(2R,3R)－丁二醇脫氫酶的體外重組表達(dá)

【摘要】目的　明確2，3-丁二醇脫氫酶（2，3-BDH）如何具有不同的立體定向性。方法　從枯草芽孢桿菌中克隆出（2R，3R）-丁二醇脫氫酶基因，將克隆的目的基因?qū)雙MD18-T載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后，將本實(shí)驗(yàn)序列和已發(fā)表序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 重組質(zhì)?？稍谥亟M菌中獲得可溶性表達(dá)。結(jié)論 利用重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)獲得了（2R，3R）-丁二醇脫氫酶。

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.24.131

作者單位：116024 大連理工大學(xué)

Recombinant Expression of（2R，3R）-Butanediol Dehydrogenase in Vitro

LUO Yajing YAN Taotao Dalian University of Technology，Dalian 116024，China

【Abstract】

Objective To establish how 2，3-BDH possesse differential stereo specificities. Methods The gene of（2R，3R）-BDH amplified from the genome of Bacillus subtilis，and was inserted into pMD18-T vector for sequencing. The constructed recombinant expression vector was sequenced， and the result of this experiment was compared with the known sequence to construct evolutionary tree. Results Soluble expression of the recombinant plasmid was obtained in the recombinant bacteria. Conclusion　（2R，3R）-BDH was obtained by induced expression in recombinant bacteria.

【Key words】　（2R，3R）-butanediol dehydrogenase，Gene clone，Soluble expression，Enzyme activity，Sequence analysis

眾所周知，2，3-丁二醇（2，3-BD），3-羥基丁酮（acetoin，AC），丁二酮（diacetyl，DA）是微生物糖類代謝過(guò)程中的產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)，化妝品，燃料，航空航天和制藥領(lǐng)域。

生物體中2，3-丁二醇的合成途徑包括三種關(guān)鍵酶：α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶和2，3-丁二醇脫氫酶。其中，2，3-BDH催化了這三種代謝產(chǎn)物之間的NAD ＋/NADH依賴的氧化還原反應(yīng)，且該酶具有底物和產(chǎn)物手性選擇性。

天然存在的很多種屬的微生物均可以表達(dá)（2R，3R）-丁二醇脫氫酶，但是這些微生物表達(dá)的（2R，3R）-丁二醇脫氫酶催化的產(chǎn)物都不是單一的，實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中我們想得到單一產(chǎn)物。因此，克隆（2R，3R）-丁二醇脫氫酶基因并在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)不失為解決產(chǎn)物不單一問(wèn)題的有效方法。將引入兩個(gè)酶切位點(diǎn)的（2R，3R）-丁二醇脫氫酶基因插入表達(dá)載體pET-28a（+）中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-Gold（DE3）中，通過(guò)卡那霉素抗性基因篩選重組菌株，通過(guò)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，利用超聲破碎方法破碎，離心后得到細(xì)胞破碎上清液，測(cè)定上清液的粗酶酶比活力。

1　方法

1.1　BDH基因PCR擴(kuò)增

取2%接種實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌，活化后平板劃線挑去單個(gè)菌落培養(yǎng)9～10 h后利用試劑盒提取基因組。設(shè)計(jì)引物，對(duì)目的片段BDH基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)上游引物 ydjL-F：CCC

GGATCC

CATGAAGGCAGCAAGATG （下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)，5’端為保護(hù)堿基），下游引物 ydjL-R：CCG CTCGAG GTTAGGTCTGACAAG （下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)，5’端為保護(hù)堿基）。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并通過(guò)DNA Gel Extraction Kit切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.2　膠回收片段與pMD18-T連接測(cè)序

根據(jù)膠回收后目的片段的濃度，計(jì)算出載體與目的片段的比例，將膠回收片段與pMD18-T在16℃下過(guò)夜連接，命名構(gòu)建的質(zhì)粒為pMD18-BDH，將質(zhì)粒用熱激法至制備好的E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞（100 μl）中。挑選出已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的白色菌落，接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8～10 h。

利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，并將提取的質(zhì)粒送至TaKaRa公司測(cè)序。

1.3　pET-28a-BDH重組質(zhì)粒構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果無(wú)誤，將BDH PCR產(chǎn)物及pET-28a（+）用限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I進(jìn)行雙酶切，37℃過(guò)夜，將100 μl酶切體系進(jìn)行電泳，試劑盒回收酶切產(chǎn)物，回收后電泳定量 ［1］。

根據(jù)切膠回收得到的BDH PCR產(chǎn)物及pET-28a（+）的濃度，按照目的片段與載體物質(zhì)量比3：1～6：1設(shè)計(jì)連接體系，16℃連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒，命名為pET-28a-BDH。

利用熱激法將pET-28a-BDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coil BL21-Gold（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。用TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，電泳定量。對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR及雙酶切驗(yàn)證，將陽(yáng)性質(zhì)粒送至TaKaRa測(cè)序，測(cè)序結(jié)果無(wú)誤，可進(jìn)行重組表達(dá)。將重組菌命名為ydjl-gold。

1.4　重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

用滅菌后的LB液體培養(yǎng)基作為空白，在分光光度計(jì)上調(diào)零。用分光光度計(jì)測(cè)定一定間隔時(shí)間的OD 550，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，得到細(xì)菌在該培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。

將帶有pET-28a-BDH重組質(zhì)粒的菌種ydjl-gold 進(jìn)行活化，根據(jù)生長(zhǎng)曲線培養(yǎng)菌體3 h左右使其OD 550＝1.0。取出1 ml發(fā)酵液保存。取出三角瓶，用水冷卻，加入IPTG，終濃度為0.5 mmol，培養(yǎng)16～20 h，取出1 ml發(fā)酵液保存 ［2］。

收集培養(yǎng)液，5 000 g，4℃離心30 min棄上清。取100 μl保存。加入適量緩沖A液使菌體重懸。在冰浴條件下超聲破碎菌體10 min（破碎條件：振幅50%，周期：0.35）。4 000 g，4℃離心30 min，收集上清。

對(duì)收集產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，所用Marker為：Premixed Protein Marker（broad），蛋白大小約為40.01 kDa。

2　結(jié)果

2.1　重組質(zhì)?？稍谥亟M菌中獲得可溶性表達(dá)

分別取ydjl-gold誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后的菌液，加上樣緩沖液，沸水煮樣10 min，制成電泳樣品。制作12%分離膠和濃縮膠，待膠凝固后拔下梳子，將樣品加入上樣孔中，110 V電泳110 min，隨后用染色液染色，再脫色，染色分為兩種方法：（1）快速染色脫色法。導(dǎo)入染色液后微波爐中火加熱30 min，倒出染色液，換脫色液微波爐中火再加熱15 min。（2）傳統(tǒng)染色法。倒入染色液后搖床震蕩過(guò)夜，加脫色液脫色。得到SDS-PAGE蛋白電泳圖顯示，在Marker的44.3 kDa所對(duì)應(yīng)的條帶處有明顯條帶，與目標(biāo)蛋白亞基大小符合 ［3-4］。

2.2　實(shí)驗(yàn)所得基因與芽孢桿菌屬的同源性較高

實(shí)驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)顯示ydjl-gold與Paenibacillus polymyxa的親緣關(guān)系最近，然后是Bacillus cereus ATCC 14579，這進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所得基因來(lái)自于芽孢桿菌屬，與芽孢桿菌屬的同源性較高。另外，可以看出枯草芽孢桿菌中BDH基因和Klebsiella pneumoniae的同源性較差，主要原因是Klebsiella pneumoniae中的meso-2，3-Butanediol Dehydrogenase屬于SDR家族。而曾有研究表明R，R-BDH可以從meso-BDH演變而來(lái)。

3　討論與展望

本文以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過(guò)PCR獲得相應(yīng)（2R，3R）-丁二醇脫氫酶基因，構(gòu)建了pET-28a-BDH重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至E.coil BL21-Gold（DE3）中，通過(guò)卡那霉素抗性基因篩選得到重組質(zhì)粒。利用重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)獲得了（2R，3R）-丁二醇脫氫酶，還可以通過(guò)以下方面進(jìn)一步研究。

（1）利用圓二色譜及微量等溫滴定技術(shù)，解析（2R，3R）-丁二醇脫氫酶二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)常數(shù)。

（2）利用分子對(duì)接軟件預(yù)測(cè)（2R，3R）-丁二醇脫氫酶與底物（2R，3R）-BD 和meso-BD 的結(jié)合模式；利用分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件，MM/GBSA的方法計(jì)算不同突變體與底物結(jié)合能，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確定定點(diǎn)突變 ［5］。

（3）利用定點(diǎn)突變的基因工程手段，原核表達(dá)突變體，重點(diǎn)表征突變體的酶相對(duì)活力參數(shù)、熱穩(wěn)定性和底物手性的選擇性。理性選擇出活性高、穩(wěn)定性高、底物選擇性好的丁二醇脫氫酶。