醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用中消毒劑的微生物污染檢測及消毒劑供試品無菌檢驗的分析

祝艷云，曹萍

吉林省敦化市疾病預(yù)防控制中心，吉林敦化 133700

為了掌握該市各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用中消毒劑微生物污染情況，加強使用中消毒劑的管理，降低院內(nèi)感染率。在使用現(xiàn)場采集各醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用中消毒劑,對采集的消毒劑進(jìn)行污染菌檢測；《醫(yī)療衛(wèi)生消毒標(biāo)準(zhǔn)2012版 （合訂本）》。

1 資料與方法

1.1 樣品采集

用無菌方法采取被檢消毒藥10 mL，加入到20 mL無菌試管中，4 h內(nèi)送檢。

1.2 檢驗過程

1.2.1 菌落總數(shù)測定 （1）樣品處理：用無菌吸管吸取消毒液1.0 mL，加入到9.0 mL含相應(yīng)中和劑的無菌生理鹽水中，震蕩20 s或80次，取1:10稀釋液進(jìn)行檢測。

（2）實驗步驟：利用滅菌后的吸管提取稀釋10倍的檢測液，共提取2 mL，將檢測液分別注入兩個消毒后的培養(yǎng)皿上（每份1 mL）。然后再取去同樣的檢測液1 mL，將其加入到9 mL的無菌生理鹽水當(dāng)中，充分震蕩約20 s后制成稀釋100倍的檢測液，再提取2 mL該檢測液，將其分別注入兩個消毒后的培養(yǎng)皿內(nèi)。選擇普通瓊脂放入水浴鍋中融化，待其冷卻到50℃左右后傾倒在各培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿內(nèi)傾倒約15 mL，傾倒后立即搖動培養(yǎng)皿，使內(nèi)部的瓊脂能夠與檢測液充分的緩和。待瓊脂完全凝固后可采用倒置培養(yǎng)方法，恒溫培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定為36℃，培養(yǎng)時間為48 h。另外選擇一個空白無菌培養(yǎng)皿，將制備的瓊脂倒入其中，待自然凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度和培養(yǎng)時間與檢測液相同，作為對照組。

（3）實驗報告：在培養(yǎng)完畢后利用肉眼對培養(yǎng)皿中菌落的數(shù)量進(jìn)行觀察，在完全記錄菌落數(shù)量后，將其放在5～10倍的電子放大鏡下進(jìn)行復(fù)查，提高菌落計數(shù)的準(zhǔn)確率。記錄同一稀釋濃度下培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的數(shù)量，取平均值作為菌落生長數(shù)。選擇其中菌落生長數(shù)量在30～300之間的培養(yǎng)皿，將菌落數(shù)與1 mL消毒劑內(nèi)所含有的菌落數(shù)量相乘，單位設(shè)定為CFU/mL，如果一個稀釋度內(nèi)無病菌生長，其報告內(nèi)菌落指數(shù)應(yīng)低于10 CFU/mL。

1.2.2 霉菌、酵母菌的測定 （1）實驗步驟：選取稀釋度為10倍、100倍和1 000倍的檢測液1 mL，分別將其注入到無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度檢測液各放入兩個培養(yǎng)皿中。選擇沙堡羅瓊脂放入水浴鍋內(nèi)融化，在溫度冷卻到45℃時，將瓊脂倒入培養(yǎng)皿當(dāng)中，并立即進(jìn)行搖動混勻，采用倒置方法在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度設(shè)定為28℃，培養(yǎng)時間為72 h，在培養(yǎng)結(jié)束后詳細(xì)記錄培養(yǎng)皿上霉菌和酵母菌的數(shù)量。另外需要選擇一個未添加檢測液的無菌培養(yǎng)皿，將沙堡羅瓊脂倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，并在瓊脂凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中，溫度和培養(yǎng)時間也檢測液相同，作為對照組。

（2）實驗報告：先對每一個培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，并計算每個稀釋濃度菌落數(shù)量的平均值，選擇菌落生長數(shù)量在5～50的培養(yǎng)皿，將菌落數(shù)與稀釋倍數(shù)相乘，所得結(jié)果即為每毫升消毒劑當(dāng)中所含有的霉菌和酵母菌的總數(shù)。

1.2.3 致病菌的檢測 （1）金黃色葡萄球菌的檢測：①病菌培養(yǎng)方法：選擇稀釋10倍的檢測液，將其加入兩倍濃縮的氯化鈉肉湯當(dāng)中，該肉湯的濃度為7.5%，其中檢測液共10 mL、肉湯10 mL。將該培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)定為36℃，培養(yǎng)時間為24 h。②病菌分離培養(yǎng):利用接種環(huán)將培養(yǎng)皿當(dāng)中的病菌取出，采用劃線法進(jìn)行接種，培養(yǎng)基為血瓊脂培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基同樣放置在溫度為36℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48 h。金黃色葡萄球菌通過血瓊脂培養(yǎng)后整體呈金黃色，菌落大而突出，外形為光滑圓形，并且在菌落周圍可見明顯的溶血圈。利用接種環(huán)挑取單個菌落進(jìn)行分離提純，采用同樣的溫度培養(yǎng)24 h。③菌落染色和鏡檢:選擇分裂提純培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行涂片，利用革蘭氏染色法，金黃色葡萄球菌呈陽性，在電子顯微鏡下其菌株排列成葡萄狀，并無芽孢分布，具有致病性的葡萄球菌個體較小，一般直徑在1μm以下。④甘露醇發(fā)酵試驗:選擇分離培養(yǎng)后的菌株，將其接種在含有甘露醇的瓊脂培養(yǎng)基上，在溫度為36℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h，能夠使甘露醇發(fā)酵并產(chǎn)生酸性物質(zhì)者判斷為陽性。⑤血漿凝固試驗:選擇稀釋4倍的人新鮮血液0.5 mL，將其加入到無菌試管當(dāng)中，并加入通過肉湯培養(yǎng)的檢測菌落0.5 mL，充分混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度設(shè)定為36℃，每隔0.5 h觀察1次試管，如果試管內(nèi)血液在6 h內(nèi)出現(xiàn)凝塊情況，則判斷其為陽性。⑥實驗報告:該次實驗當(dāng)中所生長的菌落，通過染色和鏡檢之后，如為金黃色則判定為革蘭氏陽性葡萄球菌，其能夠?qū)Ω事洞籍a(chǎn)生發(fā)酵反應(yīng)，并且凝血實驗也呈陽性，說明檢出菌落為金黃色葡萄球菌。

（2）銅綠假單胞菌的檢測：①病菌培養(yǎng):選擇稀釋度為10倍的檢測液10 mL，將其接種在普通肉湯當(dāng)中，該肉湯共濃縮2倍，劑量為10 mL，將檢測液放置在36℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h。如肉湯上方生成一層菌膜，并成黃綠或藍(lán)綠色，則說明有銅綠假單胞菌生成。②病菌分離培養(yǎng):利用接種環(huán)挑取菌落，采用劃線法接種在培養(yǎng)皿上，該培養(yǎng)基的昂中含有十六烷三甲基溴化銨，將培養(yǎng)皿放置在36℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h。該菌落生長無明顯形狀，以向四周隨機(jī)蔓延為主，菌落表面濕潤，顏色為灰白色，菌落周圍還可見明顯的水溶性色素，顏色為綠色。③染色鏡檢:在培養(yǎng)皿當(dāng)中挑取菌落，革蘭氏染色后呈陰性的，可以開展氧化酶實驗。④氧化酶實驗:選擇無菌白色濾紙放置在平皿底部，利用接種環(huán)將菌落涂抹在濾紙上，然后加入1%的二甲基對苯二胺試劑，如果在30 min內(nèi)菌落顏色變?yōu)榉凵?，則說明氧化酶反應(yīng)陽性，反之則為陰性。⑤綠膿菌素試驗:選擇菌落2～3個，將其接種在綠膿菌素鑒定培養(yǎng)基上，放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度設(shè)定為36℃，時間為24 h。培養(yǎng)結(jié)束后選擇氯仿約5 mL加入培養(yǎng)皿，充分震蕩混合，使綠膿菌素能夠溶解在氯仿當(dāng)中，此時如果試劑變?yōu)樗{(lán)色，則將試劑轉(zhuǎn)移到空試管內(nèi)，并加入1 mL鹽酸，震蕩后如果溶液上層為粉紅色，則判斷為陽性。⑥硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗:接種環(huán)挑取菌落，將其接種在含有硝酸鹽蛋白胨的水培養(yǎng)基當(dāng)中，同樣放置在溫度為36℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)時間為24 h。培養(yǎng)后如果小試管有氣體產(chǎn)生，則判斷為陽性。因為銅綠假單胞菌能夠?qū)喯跛猁}還原，并生成氮氣。⑦明膠液化試驗:對菌落進(jìn)行提純培養(yǎng)，并采用穿刺接種的方式，將其接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)部，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，培養(yǎng)完畢后直接放入冰箱保鮮層，大約0.5 h，如果取出后明膠呈液化溶解狀態(tài)，則說明呈陽性，反之呈陰性。⑧實驗報告：經(jīng)過分離提純?nèi)旧珯z查后，證明檢測液中含有革蘭氏陰性菌，氧化酶和綠膿菌素的實驗結(jié)果均呈陽性，說明其中含有銅綠假單胞菌。而如果綠膿菌素實驗呈陰性，而液化明膠、硝酸鹽還原實驗均呈陽性，則仍可說明其中含有銅綠假單胞菌。

（3）乙型溶血性鏈球菌的檢測：①病菌培養(yǎng):選擇稀釋度為10倍的檢測液10 mL，將其接種在含有濃度2倍的肉湯當(dāng)中，該肉湯中含有葡萄糖，放置在36℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，共培養(yǎng)24 h。②病菌分離培養(yǎng):用接種環(huán)挑取培養(yǎng)后的菌落，采用劃線接種方式，將其接種在血培養(yǎng)基中，同樣放置在36℃環(huán)境下，共培養(yǎng)24 h。該菌種在血培養(yǎng)基上生長的菌落顏色為灰白色，通常稱不透明狀態(tài)，菌落頂端具有針狀突起，并且邊緣光滑整齊，在菌落周圍還存在明顯的溶血圈。③染色鏡檢:接種環(huán)挑取菌落，革蘭氏染色后呈陽性，在鏡檢下菌落排列呈鏈狀。④觸酶試驗:利用接種環(huán)挑取菌落中心的菌體，將其接種在空載玻片上，選擇膠頭滴管在病菌上滴入濃度為30%的雙氧水，放置順序不可互換，否則會引發(fā)假陽性反應(yīng)。觀察載玻片上是否有氣泡產(chǎn)生，如有氣泡則視為陽性，而乙型溶血性鏈球菌應(yīng)呈陰性。⑤鏈激酶試驗:將0.02 g的草酸鉀與人體5 mL新鮮血液進(jìn)行混合，經(jīng)過充分離心后提取上清液備用。在草酸鉀血清中注入0.8 mL無菌生理鹽水，充分震蕩混合，然后將肉湯內(nèi)培養(yǎng)的菌落加入試管中，并同時加入0.25 mL的氯化鈣試劑。將試管放入溫度為36℃的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行孵化，每隔2 min對凝固程度進(jìn)行觀察，在凝固后記錄血清的融化時間，如果凝固后2 min不出現(xiàn)融化情況，則將試管轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后如血清融化，則說明為陽性。⑥桿菌肽敏感試驗:將菌落接種在血培養(yǎng)基上，利用消毒后的鑷子夾取含有0.04單位的桿菌肽試紙，并放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，如果培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)明顯抑菌帶，則判斷為陽性。⑦報告:被檢消毒劑經(jīng)增菌培養(yǎng)后，經(jīng)證實為革蘭氏陽性、呈鏈狀排列的球菌，觸酶陽性、鏈激酶試驗陽性、對桿菌肽敏感者，即可報告為檢出乙型溶血性鏈球菌。

2 結(jié)果

經(jīng)檢測，21個被檢醫(yī)療機(jī)構(gòu)的43個科室的使用中消毒劑合格率為82.6%，醇類消毒劑的合格率為92%，過氧化物類為79.3%，含氯消毒劑為97.6%，碘類消毒劑為98%,醛類消毒劑為76%，酚類消毒劑為99%；菌落總數(shù)超標(biāo)率為5.5%，霉菌和酵母菌檢出率為1.3%，金黃色葡萄球菌檢出率為2%，銅綠假單胞菌檢出率為0.8%，乙型溶血性鏈球菌檢出率為1%，有些重要科室如產(chǎn)房，口腔科等重要科室，使用中消毒劑微生物污染嚴(yán)重，合格率較低[1]。

3 討論

對使用中消毒劑的配制和使用要做到：盛裝消毒劑的器皿在消毒劑配制前應(yīng)進(jìn)行消毒滅菌(高壓蒸汽滅菌或高溫干燥滅菌)，消毒劑配制過程中要無菌操作；使用前應(yīng)認(rèn)真閱讀產(chǎn)品包裝上的產(chǎn)品說明、使用范圍、使用方法和注意事項等，并嚴(yán)格遵照執(zhí)行；消毒劑應(yīng)放置于陰涼通風(fēng)處，避光、防潮、密封保存；按產(chǎn)品說明，根據(jù)有效成分含量按稀釋定律配制所需濃度；多數(shù)消毒劑配置后穩(wěn)定性下降，要現(xiàn)用現(xiàn)配、使用前監(jiān)測濃度。連續(xù)使用的消毒劑要每日監(jiān)測濃度，或每次使用前監(jiān)測濃度；用過的醫(yī)療器械和物品，應(yīng)先去除污染，徹底清洗干凈再消毒；用于浸泡消毒時容器應(yīng)加蓋，并放于通風(fēng)良好的環(huán)境中；消毒劑均有一定的腐蝕性，不宜長時間浸泡物品或殘留在物體表面，作用時間達(dá)到后要取出并采取有效措施去除殘留消毒劑；消毒人員要做好個人防護(hù)[2]。

對使用中的消毒劑要加強管理，對不合格的醫(yī)療機(jī)構(gòu)監(jiān)督整改，定期對使用中消毒劑進(jìn)行抽樣檢測，對降低院內(nèi)感染率，避免重大院內(nèi)感染事故的發(fā)生，有著非常重要作用[3]。

[1]劉彩霞，等.醫(yī)院使用中消毒劑的監(jiān)測結(jié)果分析與管理[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(4):64-65.

[2]李曉娟,張以梅.消毒供應(yīng)中心去污區(qū)個人防護(hù)依從性的調(diào)查與分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志2015(20):4790-4791.

[3]蘇晶靜.探討供應(yīng)室護(hù)理質(zhì)量控制對降低院內(nèi)感染的可行性 [J].中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理,2015(11):224-225.