淺談適用于醫(yī)療器械眼刺激試驗的體外替代方法

田勝慧 柯軍 林美瓊 顏林 廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 （廣州 510663）

0.前言

眼刺激性是指眼睛前表面直接接觸受試物后引起的眼及其周圍粘膜可逆性炎性變化。檢測化學物刺激性的傳統(tǒng)實驗，是1944 年由Draize 等提出的兔眼實驗（Draize 試驗），是測定急性眼刺激性的國際標準。眼用藥物及可能接觸眼睛的受試物均應考慮進行眼刺激性試驗，并將其作為常規(guī)方法應用于化妝品原料及成品，醫(yī)療器械產品及眼用包裝容器等的安全性檢測中。 Draize 試驗作為眼部安全評價標準已逾幾十載，通過觀察眼部組織受損傷的程度（如結膜充血、睫狀充血、淚液分泌等，并應用螢光素鈉觀察角膜透明度的變化）來測定受試物刺激性的大小。

但此方法不僅對動物造成痛苦，而且成本高，周期長，評分系統(tǒng)主觀以及動物外推至人的種屬差異等缺點。加之近年來隨著“3R”（Reduction，Refinement，Replacement）原則的實施，動物福利日趨受到重視，兔眼刺激性試驗在倫理上和科學上均受到質疑。因此，應用體外替代試驗，減少、優(yōu)化和替代動物試驗已迫在眉睫，歐盟及多個國家已開展了有關兔眼刺激性試驗的替代方法研究，一些已經獲得驗證和認可。目前，替代方法的研究主要集中在化妝品、化妝品原料以及農藥檢測等領域，而關于醫(yī)療器械方面的報道卻很少。本文將對體內眼刺激試驗的發(fā)生機制，現(xiàn)行可供選擇的眼刺激試驗替代方法，以及其中適用于醫(yī)療器械領域的替代方法和有關這方面的研究做簡要介紹。

1.眼刺激發(fā)生機制

眼睛的前表面被角膜和結膜覆蓋，角膜是最暴露的區(qū)域，因此，也是最有可能直接接觸刺激物的部分。在Draize 試驗中，角膜損傷占眼毒性總分的73%，因此，角膜的損傷程度可以預測眼睛的最終損傷程度，而受試物自身的細胞毒性是造成角膜損傷的最主要原因。許多輕度刺激物只影響角膜上皮的表層細胞，而角膜可以在短時間內修復這種類型的損傷；輕度和中度刺激物的影響主要是上皮細胞和表面的基質；重度刺激物能穿透更深層的基質，甚至造成不可逆的損傷[1]。

角膜損傷程度（細胞損傷）和大體觀察的相關性，為開發(fā)和驗證體外眼刺激試驗的替代方法提供了機理性基礎。結膜反應通常先于角膜反應，輕微眼刺激通常只對結膜產生作用而對角膜沒有影響，角膜損傷與中度和重度刺激反應有關[1,2]。引起細胞膜裂解或蛋白質凝集的物質可產生急性細胞毒性，表面活性劑和一些有機溶劑是這類物質的典型。作用于細胞能量代謝的物質也可產生急性細胞毒性，但沒有第一類物質迅速?；瘜W物質還可以通過對大分子的烷基化或者其他修飾而發(fā)揮作用，表現(xiàn)為一種遲發(fā)性的細胞毒性（如遲發(fā)性壞死或凋亡）。

2.眼刺激試驗的替代方法

目前關于眼刺激試驗的替代方法主要分為以下幾類[3,4]：

2.1 離體器官試驗

指利用離體眼球或角膜與受試物接觸，通過檢測角膜水腫、通透性以及滲透性等指標的變化來判斷眼刺激性的體外方法。包括：BCOP （Bovine Corneal Opacity and Permeability，牛角膜渾濁和滲透性試驗）；IRE（isolated rabbit eye test，離體兔眼試驗）、ICE（Isolated Chicken Eye，離體雞眼試驗）等。2009 年，BCOP、ICE 和IRE 方法被OECD 正式認可，可作為Draize 試驗的替代試驗。此類試驗適用于重度眼刺激性物質的篩選，但對輕度刺激性物不敏感，不能作為區(qū)分刺激物和非刺激物的確認試驗。

2.2 以細胞毒性為基礎的試驗

應用細胞毒性試驗來評估受試物潛在的眼刺激性是基于一些研究表明，對眼睛產生損傷的材料（包括作用在眼的上皮和內皮組織中的材料），能在不同類型的細胞中產生細胞毒性效應。 包括：NRU（neutral red uptake assay，中性紅攝取試驗)；NRR（neutral red release assay，中性紅釋放試驗）；RBC（red blood cell haemolysis test，紅細胞溶血試驗）。NRU 試驗，通過檢測受試物抑制細胞攝取中性紅染料的能力來評價眼刺激性，中性紅攝取能力是細胞活性的標志。常用于NRU 試驗的細胞包括：中國倉鼠V79 細胞，正常人表皮角質形成細胞（normal human epidermal keratinocytes, NHEK），BALB/c 3T3 小鼠成纖維細胞和兔角膜上皮細胞系。NRU 試驗對于檢測表面活性劑與體內試驗有很好的相關性。因此，NRU 試驗更適合于評價輕度刺激物，表面活性劑類以及基于表面活性劑的配方類物質，比如洗發(fā)水等。 NRR試驗是NRU 試驗的變體，同樣適用于評價表面活性劑類個人護理產品，適用于區(qū)分非刺激物和輕度刺激物。RBC 試驗，該試驗是基于化學物質能損傷細胞膜的原理設計，通過測量標準條件下與受試物孵育的新鮮分離的紅細胞中血紅蛋白滲漏量的吸光值來評估試驗結果。氧合血紅蛋白（oxyhaemoglobin, oxyHb）變性作為第二毒性終點。哺乳動物紅細胞容易獲得，因此RBC 試驗可減少眼刺激試驗的動物使用。RBC 試驗主要適用于表面活性劑類物質的檢測，受試物可為水溶性和疏水性。

2.3 基于雞胚絨毛尿囊膜的試驗

指利用雞胚絨毛膜尿囊膜結構與人結膜相似的特點，通過檢測出血、充血、凝血等指標的變化來評價受試物的眼刺激性。包括: HET-CAM（Hen`s egg test on the chorio-allantoic membrane, 雞胚絨毛膜尿囊膜試驗）、CAMVA（Chorioallantoic membrane vascular assay，絨毛膜尿囊膜血管試驗）、CAM-TB（chicken chorioallantoic membrane - trypan blue staining，絨毛膜尿囊膜苔盼藍染色試驗）。CAM-TB 是經過改進的HET-CAM 方法，通過測定CAM 吸收臺盼藍的量來檢測受試物損傷作用，克服了其缺乏客觀性和難量化的缺點。結果表明該方法比HET-CAM 實驗方法變異性低，而且和Draize 試驗最大平均分值（maximal average score, MAS）有很好的相關性。但有色物質可能干擾終點的測定。在行業(yè)內，HET-CAM試驗可作為確定眼刺激性的篩選方法，用于配方或原材料的安全性評價中，確定可能的非刺激物或輕度刺激物，有效的減少了動物試驗。COLIPA和美國CTFA 等在內的多個機構的研究結果表明，CAMVA 方法和兔眼刺激實驗的最大平均分值(MAS)值有很好的相關性，可正確將受試物分類為刺激物和非刺激物。COLIPA 的研究結論表明CAMVA 更適合檢測水醇類物質，而HET-CAM更適合檢測表面活性劑或含有表面活性劑的配方類物質[5]?？傮w上講，此類方法適合作為化妝品和個人護理用品配方、醇類物質和表面活性劑的篩選。適合用于評價輕度到中度范圍的刺激性物質，但不能用于嚴重刺激性物質的分類。

2.4 以細胞功能為基礎的實驗

如熒光素漏出試驗（fluorescein leakage test，F(xiàn)L）。此試驗是基于以下原理設計，角膜上皮可以做為潛在危險化學物質的“不透水層”，但當其結構被破壞時就會產生眼刺激。 在FL 試驗中，用體外培養(yǎng)的貼壁細胞模仿角膜上皮，這些細胞之間可以形成緊密連接和橋粒結構，類似于“不透水層”。FL 試驗適用于篩選從輕度到中度刺激范圍類物質，并且僅適用于液體或能溶解在水或輕礦物油類物質，但其結果的重復性需要進一步的驗證。

2.5 基于重組的人角膜組織模型進行的試驗

指利用體外培養(yǎng)的類角膜組織模型評價受試物的眼刺激性。主要有美國MatTek 公司生產的EpiOcular 模型和法國SkinEthic 實驗室開發(fā)的SkinEthic?HCE 模型。目前該類方法已在化妝品、個人護理、日化和化工等領域使用，此外，還用于產品配方（輕至中度眼刺激性）的臨床前安全性檢測，以及用于配方優(yōu)化、表面活性劑及其配方（個人和家庭護理用品）的安全性評估等。

3.適用于醫(yī)療器械的替代方法探討

藥用滴眼劑瓶的材料多數(shù)為聚乙烯、聚丙烯、聚酯等高分子化合物，屬于低毒性或無刺激性化合物。因其包裝的藥品與眼部組織直接接觸, 而包裝材料中的各種添加劑可能溶出, 從而對眼產生刺激性作用。YBB00062002 國家低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶包裝標準和YBB00072002 聚丙烯藥用滴眼劑瓶的包裝標準中[6,7], 將眼刺激實驗作為重要的生物性能評價指標。隱形眼鏡護理液的安全性評價一般依據(jù)GB 19192-2003：隱形眼鏡護理液衛(wèi)生要求[8]，其中眼刺激性按中華人民共和國衛(wèi)生部《消毒技術規(guī)范》（第三版）第一分冊《實驗技術規(guī)范》1999“消毒劑毒理學實驗技術”進行檢測。根據(jù)隱形眼鏡護理液衛(wèi)生標準，直接與眼接觸的產品原液或使用液均應進行眼刺激試驗，且應達到無刺激性的合格標準。

標準GB/T 16886.10 – 2005 和ISO 10993-10：2002 中[9,10], 對于眼刺激實驗的總則規(guī)定: 只有在其他方法不能得到安全性數(shù)據(jù)的情況下才考慮進行體內實驗。31 版美國藥典中規(guī)定, 眼用制劑的包裝材料只需要進行細胞毒性的檢測。因此，在醫(yī)療器械領域使用體外方法也將是一種趨勢。研究開發(fā)適用于醫(yī)療器械的眼刺激替代方法，對于保證藥品包裝材料和隱形眼鏡護理液等的安全, 并且符合國際國內法規(guī)和標準的要求是極其重要的。替代方法的研究主要集中在化妝品、化妝品原料以及農藥檢測方面，眼用制劑則未見報道。

醫(yī)療器械類產品（藥用滴眼劑瓶和隱形眼鏡護理液）多屬于輕度或無刺激性物質，因此在考慮此類產品的替代方法時，應選擇篩選范圍在無刺激性到輕度刺激性的方法，比如HET-CAM，CAMVA 等。但是，不同替代方法都有其局限性，比如HET-CAM 適于表面活性劑類物質，CAMTB 不適于有色類物質的篩選。而CAMVA 試驗不僅可以檢測有色物質，還可以檢測固體以及不溶性物質，可以考慮使用此方法來檢測醫(yī)療器械類產品的眼刺激性?？傊?，在選擇替代方法時，首先，要考慮到各體外方法的試用范圍及其局限性；其次，要充分了解受試物的理化性質，以及可能產生眼刺激性的機理。

大多數(shù)的隱形眼鏡護理液的有效成分是表面活性劑，可能通過破壞膜的完整性，導致膜溶解而產生眼刺激，因此，我們可以考慮用NRU，RBC，HET-CAM 等方法來評估其刺激性。藥用滴眼制劑包裝材料多為聚烯烴類，屬于輕刺激或無刺激類物質，標準要求應對眼無刺激。李向輝等采用短時暴露（short time exposure, STE）方法檢測兔角膜上皮細胞的細胞毒性[11]，探討其取代Driaze 試驗的可行性。STE 實驗的靈敏度和特異性分別為100%和80%，假陽性率為20%，假陰性率為0%。研究認為，STE 試驗有潛力作為眼用制劑包裝材料的兔眼刺激試驗的替代方法，可以作為組合實驗的一部分或初篩試驗。

4.小結

相對于化妝品眼刺激試驗替代方法的研究而言，關于醫(yī)療器械眼刺激試驗替代方法的報道卻很少。從2013 年3 月起，歐盟委員會下令禁止用動物對化妝品的安全性進行測試，禁止銷售任何用動物進行測試過的化妝品，包括化妝品成分。在醫(yī)療器械領域減少動物的使用，甚至完全替代動物試驗也將是一種趨勢，因此，開發(fā)和研究適用于醫(yī)療器械安全性評價的體外替代方法勢在必行。

[1] Maurer, J.K., Parker, R.D., and Jester, J.V. Extent of initial corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2002, 36:106-117.

[2] Jester, J. Extent of corneal injury as a biomarker for hazard assessment and the development of alternative models to the Draize rabbit eye test. Cutan. Ocul. Toxicol, 2006, 25, 41–54

[3] 敖華英綜述，程樹軍審核. 化妝品眼刺激性及替代方法. 廣東檢驗檢疫技術中心, 中國替代方法研究評價中心. 2011

[4] 張文改，楊杏芬. 眼刺激試驗的替代方法及應用策略研究進展[J]. 華南預防醫(yī)學, 2007, 33(1):27-30.

[5] Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.G., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah,P.V., Curren, R.D., Miller, K. A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fund. Appl. Toxicol, 1995, 26, 20–31.

[6] YBB00062002 國家低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶包裝標準

[7] YBB00072002 國家聚丙烯藥用滴眼劑瓶的包裝標準

[8] GB 19192-2003：隱形眼鏡護理液衛(wèi)生要求

[9] GB/T 16886.10 – 2005, 醫(yī)療器械生物學評價 第10 部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗

[10] ISO 10993-10：2002, Biological evaluation of medical devices - Part 10: Tests for irritation and skin sensitization

[11] 李向輝，邱璐，邱知紅. 兔角膜上皮細胞短期暴露實驗替代兔眼實驗的可行性研究[J]. 藥學服務與研究, 2009, 9(3):182-185.