黃傘多糖的研究進展

灑榮波，孫繼政，高艷霞，唐瑜菁

（泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271000）

黃傘多糖的研究進展

灑榮波，孫繼政，高艷霞，唐瑜菁

（泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271000）

黃傘多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、抗衰老等多方面的生物活性，是目前最具開發(fā)潛力的食藥用真菌多糖。該文對黃傘多糖的來源、菌絲體發(fā)酵工藝優(yōu)化、多糖提取工藝優(yōu)化、分離提取方法、純化和組成鑒定、生物學(xué)活性進行了綜述，以期對黃傘多糖未來的研究提供理論基礎(chǔ)。

黃傘多糖；提取工藝優(yōu)化；分離提??；組成鑒定；生物學(xué)活性

黃傘（Pholiota adiposa），又名柳蘑、黃蘑、多脂鱗傘，是一種商品價值較高的食藥用真菌，是目前最具發(fā)展前景的10種珍稀菌類之一。黃傘多糖是從子實體、菌體絲以及發(fā)酵醪液等中分離出的一種高分子聚合物，這種聚合物具有多種生物活性，可以為生命物質(zhì)提供骨架支撐及能量，還在細(xì)胞的生命活動中起調(diào)節(jié)作用?！禔tlas des Champignons》中記載，黃傘是歐洲人最早試種的藥食兼用的食用菌［1］?，F(xiàn)在國外對于黃傘的研究主要集中于黃傘的藥效學(xué)研究和DNA測定上［2］，其他方面的研究并不多見。國內(nèi)對黃傘的研究較晚，直到21世紀(jì)初才逐漸開始，且僅限于在黃傘的野生馴化、生物學(xué)特性及人工栽培技術(shù)等方面進行研究。近年來大量研究表明，黃傘多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫力［3-5］、抗腫瘤［6-8］、降血脂［9-10］、抗菌［11-12］等生物學(xué)活性，更多的生物學(xué)專家將黃傘多糖的研究作為當(dāng)前的熱點之一。

1　黃傘多糖的來源

黃傘多糖的來源途徑主要有以下3種：（1）從天然黃傘子實體中提取；（2）從人工培養(yǎng)黃傘子實體中提取；（3）從發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體和發(fā)酵液中提取。自然界黃傘子實體生產(chǎn)較慢，且由于條件所限不易獲得；人工栽培黃傘子實體生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、成本較高，因而未得到全面開發(fā)。目前黃傘菌有效成分開發(fā)與應(yīng)用的主要途徑是液態(tài)發(fā)酵法，用發(fā)酵的菌絲體替代子實體作為食品、保健品或藥品的原料。從液體深層發(fā)酵獲得的菌絲體中提取黃傘多糖，是今后研究和發(fā)展的必然趨勢。

2　黃傘發(fā)酵產(chǎn)菌絲體多糖工藝優(yōu)化的研究進展

近年來，國內(nèi)許多學(xué)者對黃傘發(fā)酵產(chǎn)菌絲體多糖進行了大量工藝優(yōu)化方面的工作，這為開發(fā)利用黃傘資源奠定了基礎(chǔ)。卜慶梅等［13］通過黃傘液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方的單因素試驗和正交試驗分析，獲得黃傘液體培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖最適宜的培養(yǎng)基為蔗糖2%、麥麩3%、硫酸鎂0.15%、磷酸二氫鉀0.25%。黃清榮等［14］通過在黃傘液體培養(yǎng)基中添加不同生長因子來探索黃傘液體菌種生長的最適生長因子及其相應(yīng)濃度，以期為黃傘液體菌種在生產(chǎn)應(yīng)用方面提供理論指導(dǎo)；實驗結(jié)果表明，向黃傘液體培養(yǎng)基中加入α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、3-吲哚丁酸、L-谷氨酸、油酸和羧甲基纖維素鈉等6種因子均對黃傘菌絲體生長和胞外多糖產(chǎn)量有一定影響。王謙等［15］對黃傘深層發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化篩選，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行了正交試驗，綜合試驗優(yōu)化結(jié)果，獲得黃傘深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.2%，豆餅粉2.0%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.1%，酵母膏0.2%；深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件為起始pH值6.0，培養(yǎng)溫度25℃，搖瓶裝量100 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)周期6 d。對黃傘深層液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，為黃傘液體菌種的應(yīng)用研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

3　黃傘多糖提取優(yōu)化的研究進展

對黃傘多糖進行研究，首先要研究其提取工藝。提取黃傘多糖，首先要使黃傘多糖從細(xì)胞內(nèi)釋放，繼而穿過基質(zhì)，最終使其擴散到溶劑中，再將其收集起來的過程。因此眾多學(xué)者正廣泛關(guān)注此方面的研究進展。

為提升黃傘多糖的提取率，降低能源的損耗，減少提取所用時間，研究者針對提純萃取方法也相應(yīng)進行了優(yōu)化改進。蘇延友等［16］采用正交試驗法對影響黃傘多糖產(chǎn)量的浸提比、浸提時間和乙醇沉淀體積分?jǐn)?shù)等因素進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的黃傘多糖最佳提取工藝條件為浸提比1∶20、浸提時間2 h、乙醇沉淀體積分?jǐn)?shù)90%；張桂春等［17］對經(jīng)過深層發(fā)酵的黃傘發(fā)酵醪液采取單因素試驗和正交試驗法，對提取黃傘胞外多糖的相關(guān)工藝技術(shù)進行了研究，最終獲得黃傘多糖的最佳提取條件為醇沉?xí)r間10 h，乙醇醇沉體積分?jǐn)?shù)90%，醇沉溫度4℃，醇沉pH 7.0。李德海等［18］在單因素試驗基礎(chǔ)上，采取響應(yīng)面法優(yōu)化了微波輔助提取黃傘多糖的工藝條件，最終得到黃傘多糖最佳提取工藝條件為微波時間2 min，微波功率490 W，料液比1∶21，水浴時間1.6 h；在優(yōu)化后的工藝條件下進行驗證試驗，最終黃傘多糖提取率為17.69%。

4　黃傘多糖的分離提取方法

4.1溶劑萃取法（熱水浸提法）

由于多糖在有機溶劑中溶解度幾乎為零，故溶劑萃取法是利用多糖的這種性質(zhì)，向萃取液中加入高濃度乙醇、甲醇或丙酮，這樣多糖可以從萃取液中沉淀出來，進行初步提純，然后通過萃取獲得粗多糖。張俐娜等［19］利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉水溶液、體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的草酸銨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和0.05%的氫氧化鈉和硼氫化鈉以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%和2%的氫氧化鈉和尿素提取出了4種雜多糖和2種葡聚糖；陳小麗等［20］研究了蛹蟲草子實體多糖的提取工藝條件，利用堿法對蛹蟲草子實體多糖進行提取，最終獲得最佳提取工藝為向粗多糖溶液中加入8倍體積的0.5 mol/L氫氧化鈉，先后提取3次，每次提取0.5 h。

由于溶劑萃取法使用的溶液極性較大，這種情況下一些易溶于水的物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、糖苷類等）會被同時浸提出來，這樣會導(dǎo)致萃取液在儲存時較易變質(zhì)，為進一步的提純帶來影響，且提取耗時費力。

目前常用的是熱水浸提法。大多數(shù)種類的多糖能夠在水中溶解，在熱水中尤其如此，不同的是，在乙醇等有機溶劑中，則形成固態(tài)沉淀沉積下來，所以大多數(shù)實驗室采用的多糖的提取制備方法是水提醇沉法。此方法主要是借助于熱力學(xué)作用使黃傘菌細(xì)胞首先發(fā)生質(zhì)壁分離，類似于水的液體會滲入黃傘質(zhì)壁分離后的間隙，即細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)中，將液泡中的物質(zhì)溶解，使其穿過細(xì)胞壁，擴散到外部溶劑中［21］。李德海等［22］總結(jié)歸納黃傘粗多糖常用提取工藝基本過程有以下幾步：脫水的黃傘菌株或菌絲→破碎處理→水提醇沉法→酶法提取輔之于超聲加壓提取→濃縮→乙醇沉淀→除雜質(zhì)（Sevage法）→乙醇清洗→脫水處理→黃傘粗多糖。

熱水浸提法的優(yōu)點為實驗提取設(shè)備簡單，操作步驟方便快捷，提取成本低廉，適合大規(guī)模的工廠生產(chǎn)；不足之處是必須重復(fù)多次浸提，耗費時間和大量原料，且勞動強度大，更嚴(yán)重的是浸提次數(shù)的增加還會導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)被破壞，進而導(dǎo)致其生物活性的部分喪失。

4.2超聲波輔助加壓提取法

超聲波輔助高壓提取多糖是一種物理破碎過程，這種方法的原理是利用超聲波產(chǎn)生的空化作用形成高溫和高壓環(huán)境，這種空化作用會造成真菌細(xì)胞壁破裂。王謙等［23］利用超聲法提取黃傘發(fā)酵液多糖，利用超聲波輔助加壓法從黃傘發(fā)酵醪液中提取多糖，通過單因素試驗及正交試驗確定最佳的多糖提取條件為超聲波作用時間35 min，作用時壓力0.12 MPa，提取時間39 min。

相對于常規(guī)的多糖提取方法，超聲提取法具有自身的優(yōu)點，如節(jié)約時間、節(jié)省原料、提取率高且無需加熱，但是超聲提取法的缺點也很明顯，如超聲時間不宜過長，時間過長會使多糖鏈斷裂，且多糖的結(jié)構(gòu)也會隨之發(fā)生變化［24］。一般情況下，超聲處理時間＞1 h，多糖的分子質(zhì)量會減少80%。基于這個原因，在進行超聲波輔助提取多糖時，不能使用過長的超聲處理時間。

5　黃傘多糖的純化與組成鑒定

5.1黃傘多糖的純化

5.1.1除蛋白

目前，主要有3種方法用于多糖除蛋白。

Sevage法：將氯仿和正丁醇以5∶1體積比混合后，將混和液加入黃傘多糖的樣品水溶液中不斷振搖，振搖后于室溫條件下靜置1 h，然后進行離心以除去混和液中凝膠狀蛋白質(zhì)，如此反復(fù)多次直至將混和液中的蛋白質(zhì)除盡。在除蛋白的方法中，Sevage法是比較經(jīng)典的方法，它的缺點是步驟繁瑣、耗時較多，更重要的在除蛋白過程中多糖損耗較大。

氟里昂-113法：將氟里昂-113和黃傘多糖溶液按1∶1比例混合，然后在4℃條件下攪拌10 min左右，靜置10 min后3 000 r/min離心吸取上清液，此上清液即為無蛋白的多糖溶液。這種方法的優(yōu)點是效率較高，但也有明顯的缺點，由于氟里昂-113沸點較低，只適合在實驗室小規(guī)模條件下使用，不適合于工業(yè)化大規(guī)模使用。

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法：在多糖水溶液中滴加3%TCA，當(dāng)多糖溶液由渾濁變澄清結(jié)束，室溫條件下放置過夜，然后于5～10℃的條件下3 000 r/min離心10 min，除去沉淀后可以得到除蛋白的多糖溶液［25］。TCA法的缺點是過程操作比較劇烈，很容易引起某些多糖的降解。

5.1.2黃傘多糖的脫色

游離色素和結(jié)合色素兩種色素一般情況下會存在于粗多糖中。色素脫除方法很多，比較常用的脫色方法主要有氧化法、離子交換法、吸附法、金屬絡(luò)合物法。

二乙氨乙基（dicthylaminoethyl，DEAE）-纖維素法是其中應(yīng)用最為廣泛的色素脫除方法。它的原理是黃傘多糖溶液通過離子交換柱，這樣一方面可以對黃傘多糖溶液進行脫色，另一方面還可以初步分離黃傘多糖。DEAE-纖維素法常用H2O2作為氧化法的脫色氧化劑，其操作溫度一般在4℃左右，操作濃度也不宜過高，這樣可以避免多糖的部分降解。該法也有它的不足之處，黃傘多糖溶液中的色素被脫色氧化劑氧化后，提取液中仍然會存在，這樣就會導(dǎo)致最終提取的多糖質(zhì)量不高。另一種較為常用的脫色法是吸附脫色法，通過采用活性炭、硅藻土等作為吸附劑，色素附著于吸附劑達到脫色的目的，其缺點是吸附劑吸附色素的同時，也會吸附一部分多糖，這樣就會造成多糖的損失。對于有些多糖溶液，其中不僅含有游離蛋白，而且還含有色素，為了達到提純的目的，必須通過生成金屬絡(luò)合物的方法除去蛋白和色素。方法是向多糖提取液中加入菲林試劑，生成易于分離的不溶性絡(luò)合物，經(jīng)過分離后的絡(luò)合物使用陰離子交換樹脂進行分解。

5.1.3黃傘多糖小分子雜質(zhì)的去除

黃傘多糖溶液中除了含有蛋白和色素外，含有大量小分子雜質(zhì)。多糖中的小分子雜質(zhì)可以通過逆向水流透析、超速離心或用孔徑不同的濾膜進行超濾去除。

5.2黃傘多糖組分鑒定

聶永心等［26］將黃傘粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白與活性炭脫色得到精制黃傘多糖。通過對其水解衍生由色譜方法測得黃傘子實體多糖的單糖組分為木糖、甘露糖、葡萄糖，各單糖百分含量分別為1.03%、2.30%和96.7%?；葚S立等［27］對黃傘進行營養(yǎng)成分分析，發(fā)現(xiàn)黃傘中粗脂肪含量比普通食用菌要低，而多糖含量比普通食用菌要高，含量可以超過4%；黃傘中所存在的氨基酸種類豐富，有18種，與其他種類食藥兼用菌所相比，有較高的含量。褚學(xué)英等［28］發(fā)現(xiàn)，黃傘所含有的蛋白質(zhì)中，異亮氨酸（isoleucine，Ile）和賴氨酸（lysine，Lys）兩種氨基酸的含量比較高。由于一般谷物中Ile和Lys這兩種氨基酸的含量較低，因此可以把黃傘多糖與谷物在食用時相互補充，這樣就可以使蛋白質(zhì)起到互補作用，從而可以進一步提高食物當(dāng)中的蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。

6　黃傘多糖的生物學(xué)活性

6.1機體免疫調(diào)節(jié)作用

有實驗表明，黃傘多糖具有多種生物活性藥理功能，如抗菌、抗氧化、美容美白等作用，免疫調(diào)節(jié)作用是特別需要強調(diào)的［29］。在目前已知的眾多真菌多糖化合物中，具有免疫調(diào)節(jié)功能，激活或提高腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）的吞噬能力是大多數(shù)真菌多糖化合物所具有的作用［30］。將T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，進一步激活補體，可以增加干擾素和白細(xì)胞介素的產(chǎn)生［31］。蘇延友等［32］從泰山黃傘中提取出黃傘多糖，應(yīng)用于動物實驗研究了黃傘多糖的藥理學(xué)作用，觀察黃傘多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的激活效應(yīng)。實驗結(jié)果表明，黃傘多糖可以提升實驗用小鼠的免疫作用，通過激活巨噬細(xì)胞、增強細(xì)胞因子分泌、提高NO的產(chǎn)生水平、增強吞噬致病因子的能力以及體外殺傷活性等多種途徑來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。

6.2抗腫瘤作用及促進非特異性免疫功能

由于多糖可以激活免疫細(xì)胞，并且可以調(diào)整機體的免疫應(yīng)答能力，但不會對宿主正常細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，因此多糖被看作一種可以調(diào)節(jié)生物效應(yīng)的藥劑［33］。蔣曉琴等［34］從泰山產(chǎn)黃傘子實體中提取出黃傘粗多糖，通過動物體內(nèi)試驗，向接種S180肉瘤細(xì)胞胃內(nèi)灌注不同濃度的黃傘多糖溶液，連續(xù)操作12 d，觀察黃傘多糖對荷瘤小鼠模型的機體非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能的影響。結(jié)果表明，黃傘多糖能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用，增強非特異性免疫功能，顯著提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與吞噬率以及外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，最終可以顯著提高血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量［35］。

6.3殺菌、抗感染作用

通過提高免疫系統(tǒng)在宿主體內(nèi)的功能，激活或提高TAMs的吞噬能力是黃傘多糖在殺菌、抗感染方面發(fā)揮作用的主要原因［36］。另外，黃傘多糖可以預(yù)防葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎桿菌和結(jié)核桿菌的感染［37］。

6.4自由基清除作用

胡清秀等［38］對黃傘多糖的藥理學(xué)作用進行了研究，結(jié)果表明，從黃傘子實體和菌絲體中提取的多糖均可以較好地清除自由基，且多糖質(zhì)量濃度和對自由基的清除作用呈線性關(guān)系。在抗氧化多糖的研究過程中，有很多實驗顯示，多糖所起到的抗氧化活性，極有可能是多糖抗癌變、抑制細(xì)胞衰老、殺菌抗感染、抗射線輻射等其他活性的作用機理之一。而對于先導(dǎo)化合物進行一定程度的結(jié)構(gòu)方面的改進，為多糖在抗氧化方面的發(fā)展前景貢獻了一個不錯的思路。

6.5機體保健作用

李德海等［22］在對黃傘多糖關(guān)于高血脂的作用研究時表明，黃傘多糖可以明顯減少患有高血脂癥小鼠的血清總膽固醇在血液中的比例。因此，黃傘多糖對于高血脂疾病有一定程度的預(yù)防作用。

7　展望

目前國內(nèi)外的科學(xué)家從數(shù)量眾多的高等擔(dān)子菌中經(jīng)過層層篩選，分離得到200多種有生物活性的多糖物質(zhì)，發(fā)展至今已有數(shù)十年，市場上投放的已有上百種真菌多糖類保健品。在這些真菌多糖類保健品中，典型代表之一即為黃傘多糖。前人通過將黃傘多糖用于動物實驗，證明黃傘多糖對于人類疾病的治療以及保健均具有一定的積極作用，對黃傘多糖對于人類免疫功能的作用和提取分離工藝的研究，能夠促進如黃傘這樣的食藥兼用真菌的進一步開發(fā)與深層次加工，但國內(nèi)外對黃傘多糖的高級結(jié)構(gòu)、合成途徑、藥理學(xué)機理以及深層結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究的不夠深入；與此同時，有必要進一步擴大黃傘多糖的實際應(yīng)用領(lǐng)域，以此更大程度發(fā)掘黃傘多糖的應(yīng)用潛能。

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［33］張彩鳳，田莉瑛，張雪梅，等.真菌多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究進展［J］.生命科學(xué)儀器，2008，6（10）：17-21.

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Research progress ofPholiota adiposepolysaccharide

SA Rongbo，SUN Jizheng，GAO Yanxia，TANG Yujing
（School of Life Sciences，Taishan Medical University，Taian 271000，China）

Pholiota adiposapolysaccharide has much biological activity，such as regulating immunity，anti-tumor，reducing blood lipid，antibacterial，anti-oxidation，anti-aging，and so on.It is the most potential edible and medicinal fungi polysaccharide for development.TheP.adiposapolysaccharide source，mycelium fermentation process optimization，polysaccharide extraction process optimization，extraction and separation method，purification and composition identification，polysaccharide biological activity were reviewed，in order to provide theoretical basis for future research ofP.adiposa polysaccharide.

Pholiota adiposapolysaccharide；extraction process optimization；separation and extraction；composition identification；biological activity

O636.1

A

0254-5071（2015）10-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.003

2015-09-01

山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2012CL02）

灑榮波（1978-），男，副教授，博士研究生，主要從事微生物發(fā)酵及生物活性物質(zhì)應(yīng)用研究工作。