乳品污染菌的基因組學(xué)研究及其在生產(chǎn)控制上的應(yīng)用

王麗群，國(guó)立東

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，哈爾濱150086；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040）

0 引言

自乳品工業(yè)興起以來(lái)，就有了涉及乳品和乳制品的食品中毒和引發(fā)其他疾病的報(bào)道，自1972年到2000年，美國(guó)共發(fā)生58起鮮奶致病事件，每年平均約2起。乳品污染事件的“罪魁禍?zhǔn)住倍嘁怎r奶中的沙門(mén)氏菌、李斯特菌以及空腸彎曲菌為主。多年來(lái)與乳中污染菌檢測(cè)、定量及鑒定等方面研究較多，目前，公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)可查詢的微生物全基因組總數(shù)可達(dá)566個(gè)，不完整的基因組841個(gè)，還有許多未經(jīng)記錄菌株。隨著基因組學(xué)和基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的基因組信息將公布于眾，此外，基因組信息學(xué)對(duì)人們認(rèn)識(shí)新的細(xì)菌性狀、菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)所產(chǎn)生的突變基因以及新的檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)方面都會(huì)提供很多幫助。

1 乳中常見(jiàn)污染細(xì)菌及其基因組序列的研究情況

早期通過(guò)乳品傳播的疾病主要有結(jié)核、白喉和猩紅熱等，近年來(lái)的研究就主要集中在乳中傳播的多種致病性細(xì)菌和腐敗細(xì)菌上。乳及乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富且pH值近中性等特點(diǎn)為許多微生物包括病原細(xì)菌和腐敗細(xì)菌提供了良好培養(yǎng)基。乳中污染細(xì)菌大致可以分為三類，即人源致病菌，包括空腸彎曲桿菌、腸出血性大腸桿菌[1]、沙門(mén)氏菌屬[2]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[3]、蠟樣芽孢桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森（氏）菌等；能夠引起牛乳房炎的微生物，如乳房鏈球菌、人源致病菌金黃色葡萄球菌[4]和無(wú)乳鏈球菌等；還有腐敗微生物（非致病細(xì)菌）多種嗜冷菌及芽孢桿菌，如嗜冷性熒光假單胞菌[5]、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。從研究結(jié)果來(lái)看，目前許多細(xì)菌已經(jīng)獲得全基因組序列，包括上述的一些人類病原菌和腐敗微生物，但是這些菌株中只有少部分測(cè)序菌株是直接分離于乳制品的。細(xì)菌基因組學(xué)的一個(gè)重要應(yīng)用就是能夠?qū)ξ⑸锇踩笆称焚|(zhì)量加以控制。

1.1 乳中人源致病菌基因組學(xué)

人源致病菌的典型測(cè)序菌株包括分離自干酪的蠟狀芽孢桿菌[6]和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[3,7]及分離自原料乳的高毒性空腸彎曲桿菌[8]。

蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌是在醫(yī)學(xué)和生物防御學(xué)上具有非常重要意義的一類微生物，這幾個(gè)菌株的全基因組序列也非常相近。但是，研究發(fā)現(xiàn)這類微生物所表現(xiàn)出的疾病和宿主之間的特異性往往取決于質(zhì)粒，當(dāng)不同菌株所含質(zhì)粒的大小和數(shù)目不同時(shí)，其染色體通常會(huì)表現(xiàn)出很強(qiáng)的一致性及蛋白質(zhì)相似性，甚至連基因的差異都很有限[6]。不過(guò)，在對(duì)這些菌株進(jìn)行基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)應(yīng)用其他基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)就能對(duì)這些菌株的一些功能性進(jìn)行深入研究。

從干酪、香腸和肉制品中分離出來(lái)的三株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌F2365、F6854和H7858的基因組得以分析，結(jié)果表明他們分別含有51、97和69個(gè)特異性基因，這些菌株及其不同的特異性基因很可能會(huì)對(duì)其病原性及其在不同環(huán)境中的生存能力產(chǎn)生影響。另外，與菌株F2365相比，菌株H7858和F6854的基因組序列中分別發(fā)現(xiàn)8603和105050個(gè)高質(zhì)量的單核甘酸多態(tài)性。通過(guò)基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，三株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的基因組在本質(zhì)上是相互聯(lián)系的，其差異主要體現(xiàn)在噬菌體插入位點(diǎn)、轉(zhuǎn)座因子和SNPs上[7]。

空腸彎曲桿菌是一種常見(jiàn)于人腸道內(nèi)的病原菌，具有很明顯的菌株-菌株間差異性，這種差異能夠直接導(dǎo)致其病原潛力的差異。C.jujuni81-176因其能夠表現(xiàn)出獨(dú)特的病原特征并具有很強(qiáng)毒力而常用于實(shí)驗(yàn)室研究，通過(guò)該菌株進(jìn)行基因組學(xué)分析，能夠找出大量的與其特定代謝性質(zhì)和病原性質(zhì)相關(guān)的遺傳特征，經(jīng)過(guò)鑒定還發(fā)現(xiàn)該菌株為獲得遺傳信息而能夠發(fā)生整合的不穩(wěn)定區(qū)域[8]。這些研究更加有助于我們理解空腸彎曲桿菌的發(fā)病機(jī)理，特別是發(fā)現(xiàn)一些高致病性菌株所具有的一些獨(dú)特特征。

1.2 乳中其他致病菌的基因組學(xué)研究

金黃色葡萄球菌能夠引發(fā)乳房感染，嚴(yán)重影響牧群健康和原料乳質(zhì)量，Leigh等[9]對(duì)一株分離于牛乳房炎的Str.uberis進(jìn)行基因組測(cè)序分析，并對(duì)該菌株引發(fā)疾病的機(jī)理方面做了相關(guān)驗(yàn)證，如果將上述結(jié)果同疾病模型和后基因組學(xué)分析相結(jié)合就能進(jìn)一步闡述致病菌與宿主之間的相互作用關(guān)系。另外已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注的菌株是來(lái)源于牛臨床分離物的菌株副結(jié)核分枝桿菌，因?yàn)樗芤l(fā)牛副結(jié)核病（一種發(fā)生于牛和其它反芻動(dòng)物體內(nèi)的慢性持續(xù)性腸炎）。2005年，副結(jié)核分枝桿菌菌株K-10的全基因組序列已經(jīng)完成，經(jīng)分析其基因組共有4,829,781個(gè)堿基，4,350個(gè)ORFs，45個(gè)tRNA和一個(gè)rRNA操縱子[10]，副結(jié)核分枝桿菌基因組序列的獲得為進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)蛋白的毒力特性和生理學(xué)研究以及新的檢測(cè)牛副結(jié)核病方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

1.3 乳中腐敗菌的基因組學(xué)研究

腐敗菌也是影響乳制品質(zhì)量的重要因素之一，如熒光假單胞菌[5]產(chǎn)生的一些蛋白酶和肽酶，往往不能經(jīng)過(guò)一般熱處理而失活，在產(chǎn)品貨架期間會(huì)產(chǎn)生苦味、風(fēng)味淡薄及其他一些質(zhì)地缺陷；而能夠形成芽孢的菌株，例如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌也是主要潛在腐敗微生物，在巴氏殺菌乳中，熱處理基本上能夠失活所有不能形成芽孢的細(xì)菌，但是由于芽孢能夠在經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后存活并再次萌發(fā)同樣會(huì)對(duì)乳品質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重影響。上述這些細(xì)菌能夠適應(yīng)多種自然環(huán)境，這是有其基因多樣性決定的，通過(guò)比較基因組雜交法分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株之間存在非常大的遺傳異質(zhì)性；芯片雜交顯示枯草芽孢桿菌的168個(gè)特異性基因中有近三分之一能夠表現(xiàn)出變異性[11]。

乳中各種病原菌和腐敗菌的污染情況與農(nóng)場(chǎng)、飼料及貯存條件等密切關(guān)，這些污染的微生物由于生存環(huán)境和所受應(yīng)激的差異，同種菌株的基因組之間存在著很大的多樣性和差異性，但是為了對(duì)食品相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行研究，我們通常選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株或模式菌株進(jìn)行研究。所以，目前在乳中污染微生物基因組研究方面存在的一個(gè)問(wèn)題是，乳中存在的天然菌株與實(shí)驗(yàn)室保藏的參考菌株在特性上存在許多差異，天然菌株往往具有或不具有很多參考菌株所不具有的一些特性，而這些特性又會(huì)直接在其基因組上有所體現(xiàn)。因此，為了更好將基因組學(xué)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，我們需要了解更多來(lái)源于乳中天然菌株的基因組序列，進(jìn)而對(duì)這些序列進(jìn)行比較分析，以更好的反映不同菌株特性與基因組之間的聯(lián)系，為將基因組學(xué)應(yīng)用于乳品生產(chǎn)控制方面奠定基礎(chǔ)。

2 基因組學(xué)在乳品生產(chǎn)控制上的應(yīng)用

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)臨床標(biāo)本中病原菌和腐敗菌的檢驗(yàn)大多仍采用所謂的“金標(biāo)準(zhǔn)”——培養(yǎng)法，其缺點(diǎn)是耗時(shí)、耗力、耗材。在對(duì)乳品生產(chǎn)安全的控制方面，基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)具有逐漸取代耗時(shí)、準(zhǔn)確性差和靈敏度不足的傳統(tǒng)培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)試驗(yàn)等方法的趨勢(shì)，而將乳品微生物檢測(cè)帶入成本更低、速度更快且診斷潛力更強(qiáng)的核酸技術(shù)時(shí)代。但是，需要注意的一點(diǎn)是，核酸技術(shù)在微生物檢測(cè)中應(yīng)用的前提是乳品中關(guān)鍵要控制的微生物基因組學(xué)的研究深度，另外對(duì)該微生物進(jìn)行菌種鑒定和菌株計(jì)數(shù)時(shí)靶基因的選擇也要適當(dāng)。通常我們對(duì)菌株進(jìn)行鑒定時(shí)所選擇的靶序列一方面要對(duì)同種微生物具有高度保守性（如16SrDNA），另一方面，又要對(duì)不同種、亞種微生物具有選擇性和靶向特異性。當(dāng)針對(duì)于不同檢測(cè)目的的靶序列確定后，我們便可以對(duì)乳中污染微生物進(jìn)行定量和定性檢測(cè)[12]，包括單一菌株分析和群落分析，以及一些毒性基因及抗性基因的檢測(cè)和細(xì)菌在環(huán)境應(yīng)激條件下產(chǎn)生的各種基因突變等。

2.1 乳中細(xì)菌鑒定

以DNA為基礎(chǔ)的細(xì)菌鑒定技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為很多種，包括實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)、靶基因序列分析、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析、多位點(diǎn)序列分析及基因芯片等。研究發(fā)現(xiàn)，生物細(xì)胞rDNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中既具有保守區(qū)，又具有可變區(qū)。保守的片段反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變的片段則表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則是不同分類級(jí)別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎(chǔ)。在對(duì)乳中細(xì)菌進(jìn)行鑒定時(shí)，靶基因一旦確定，對(duì)于我們將現(xiàn)有細(xì)菌鑒定方法和檢測(cè)技術(shù)結(jié)合使用來(lái)說(shuō)是有利的。

MLSA是在多位點(diǎn)酶電泳的理論基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種分子鑒定方法，該方法最初只用于腦膜炎雙球菌的鑒定[13]，隨后該方法又成功地鑒定了幾種其他的病原菌，如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌[14]、空腸彎曲桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[13]等。該方法利用自動(dòng)化的DNA順序分析對(duì)不同管家基因上等位基因的特征進(jìn)行描述。由于微生物的核甘酸序列之間存在很大的差異性，所獲得的結(jié)果可以到互聯(lián)網(wǎng)上相應(yīng)的文庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。該方法也適合作為通用的流行病學(xué)研究方法。

此外，能對(duì)多種不同菌種和特定微生物性狀進(jìn)行快速檢測(cè)和計(jì)算的芯片技術(shù)在乳品安全控制上的研究也越來(lái)越多，Champion等利用基因芯片對(duì)111株空腸彎曲桿菌的全基因組進(jìn)行比對(duì)，再通過(guò)基因分型和一些計(jì)算方法對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，而獲得了這一重要食源致病菌系統(tǒng)分化模型，這在控制該菌所引發(fā)的疾病方面具有重要意義，相應(yīng)方法同樣適合其他病原微生物的研究[15]。

2.2 乳中細(xì)菌定量

在乳制品或食品的質(zhì)量安全鑒定方面，快速檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)是許多研究者所致力追求的目標(biāo)。核酸診斷技術(shù)省去了傳統(tǒng)方法中必須進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，而是通過(guò)體外擴(kuò)增DNA技術(shù)對(duì)食源性致病菌或腐敗菌進(jìn)行定量或鑒定，與傳統(tǒng)方法相比，能在更短時(shí)間內(nèi)對(duì)食物中單一或復(fù)雜的病原菌進(jìn)行靈敏且特異性的檢測(cè)[16,17]。另外，分子生物傳感器的出現(xiàn)將促進(jìn)在線生物分析的發(fā)展，而利用芯片技術(shù)對(duì)復(fù)雜病原菌菌群進(jìn)行定量和鑒定也將是未來(lái)核酸診斷技術(shù)的一個(gè)發(fā)展方向。聚合酶鏈反應(yīng)是目前來(lái)說(shuō)對(duì)牛乳中微生物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)檢測(cè)限最低的一種檢測(cè)技術(shù)，雖然在實(shí)際應(yīng)用PCR技術(shù)時(shí)仍然會(huì)受到一些限制，部分原因在于樣品制備上存在難度，因?yàn)槿橹泻枯^高的脂肪和蛋白質(zhì)可能會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增起抑制作用，但是其最低檢測(cè)限仍可以達(dá)到一個(gè)細(xì)胞/mL[16]。美國(guó)國(guó)家動(dòng)物健康監(jiān)護(hù)系統(tǒng)在2002年分別利用傳統(tǒng)方法、常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)全美乳樣中含有傷寒沙門(mén)氏菌的情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，對(duì)于從美國(guó)21個(gè)州854個(gè)農(nóng)場(chǎng)獲得的樣品，經(jīng)傳統(tǒng)方法檢測(cè)出的乳樣有22個(gè)，經(jīng)常規(guī)PCR檢測(cè)出的乳樣有94個(gè)，而經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)出的乳樣有100個(gè)[18]。與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)PCR更不易于污染，并且勞動(dòng)量更少。鑒于這些原因，實(shí)時(shí)PCR具有取代常規(guī)PCR而成為分子診斷學(xué)的常用方法。目前，實(shí)時(shí)定量PCR已經(jīng)用于各類病原菌的檢測(cè)和定量，也用于一些存在于環(huán)境中的特定細(xì)菌的計(jì)數(shù)[19]。

盡管目前DNA相關(guān)檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是由于來(lái)源于死細(xì)胞的DNA降解速度很慢，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果[20]。與之相比，RNA在對(duì)乳中細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定方面不同于DNA，因?yàn)槠湓谖⑸锼劳鲆院笱杆俳到?，這樣就可以有針對(duì)性的只檢測(cè)大多數(shù)有活力的細(xì)菌。此外，mRNA和rRNA在數(shù)量上要高于基因組DNA，而能進(jìn)一步降低檢測(cè)限度。因此，RNA相關(guān)技術(shù)在對(duì)乳中細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)方面同樣具有很強(qiáng)的推廣優(yōu)勢(shì)。

2.3 抗生素抗性基因的檢測(cè)與監(jiān)控

食品企業(yè)對(duì)原料奶中抗生素殘留要求很嚴(yán)格，尤其是對(duì)發(fā)酵性乳制品來(lái)說(shuō)，抗生素殘留所帶來(lái)的危害是巨大的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)發(fā)酵劑都不具備抗生素抗性。但是，伴隨著抗生素在動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)中的頻繁使用，促使許多具有腐敗特性和毒性的乳品污染微生物都攜帶了抗生素抗性基因，這對(duì)人類健康及醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展來(lái)說(shuō)是不利的，而且更為嚴(yán)重的是，這些含有抗生素抗性的污染菌不僅自身具有抗生素抗性，并且還能向人胃腸道中其他敏感細(xì)菌轉(zhuǎn)移抗生素抗性基因。從目前研究結(jié)果來(lái)看，美國(guó)在這方面的相關(guān)報(bào)道較多，例如，Murinda等曾對(duì)從牛奶場(chǎng)分離物中獲得的24株大腸桿菌進(jìn)行鑒定[21]，研究發(fā)現(xiàn)其中10株大腸桿菌具有抗生素抗性，8株大腸桿菌的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型整合子，而且有7株大腸桿菌能夠?qū)煞N或兩種以上的抗生素產(chǎn)生抗性；Ray等對(duì)分別從傳統(tǒng)和正規(guī)牛奶場(chǎng)獲得的沙門(mén)氏菌的抗生素抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究認(rèn)為來(lái)源于不同牛奶場(chǎng)的沙門(mén)氏菌對(duì)大多數(shù)抗生素而言所表現(xiàn)出的抗性是相似的，但是來(lái)自傳統(tǒng)牛奶場(chǎng)的沙門(mén)氏菌中至少有一株能夠同時(shí)抵抗五種抗生素[22]。

目前關(guān)于食源性病原菌在抗生素抗性基因傳播過(guò)程中所擔(dān)當(dāng)?shù)慕巧呀?jīng)成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)，為了鑒定、監(jiān)控和控制乳品環(huán)境中抗生素抗性基因，研究者們希望能夠通過(guò)發(fā)展基因組學(xué)技術(shù)而產(chǎn)生一些更特異更快速的定量監(jiān)測(cè)方法。Srinivasan等對(duì)具有抗生素抗性的19株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的基因序列進(jìn)行分析，分別發(fā)現(xiàn)了不同抗生素抗性基因編碼的序列[23]，如floR、penA、strA、tetA和sulI，而其他抗生素抗性基因（cmlA，strB，aadA，vanA，vanB，ampC，ermB，ereA和ereB）和剩余部分四環(huán)素抗性基因（tetB，tetC，tetD，tetE和tetG）則未能在從牛奶場(chǎng)中分離出來(lái)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的基因組中發(fā)現(xiàn)；此外，Yu等采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)來(lái)源于不同環(huán)境樣品中的三種四環(huán)素抗性基因（tetA、tetC和tetG）進(jìn)行檢測(cè)[19]，并對(duì)殘留于動(dòng)物糞便中的抗生素抗性基因?qū)Νh(huán)境產(chǎn)生的影響做出趨勢(shì)判斷，這些研究都為今后攜帶抗生素抗性基因致病菌的定量檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)果與展望

對(duì)于乳品生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，致病菌和腐敗菌污染是影響原料乳質(zhì)量的重要因素，對(duì)乳原料中微生物進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的定量和定性一直都是行業(yè)人士的研究重點(diǎn)，此外，關(guān)于乳中污染微生物對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)情況及對(duì)其殘存情況的實(shí)時(shí)監(jiān)控等方面也與乳品產(chǎn)品質(zhì)量直接相關(guān)?；蚪M學(xué)的發(fā)展為我們了解微生物和開(kāi)發(fā)各種新興的核酸分子檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。在基因組學(xué)的理論指導(dǎo)下，一些以基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)乳品生產(chǎn)中的微生物進(jìn)行定量、檢測(cè)及鑒定技術(shù)已經(jīng)得以開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于生產(chǎn)中，而且相應(yīng)的研究仍在繼續(xù)，如，針對(duì)多個(gè)物種情況進(jìn)行分析的宏-基因組技術(shù)或群落分析，各種致病基因和抗性基因的定位和比較以及結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)致病菌產(chǎn)生的一些綜合性細(xì)胞應(yīng)答方面的研究，當(dāng)然還要進(jìn)行一些適合生產(chǎn)實(shí)際的、低成本技術(shù)的開(kāi)發(fā)，因?yàn)榛蚪M序列分析的高成本是限制其深入研究和應(yīng)用于生產(chǎn)的主要原因。

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