反向遺傳技術(shù)及其在豬病防控研究中的應(yīng)用

祖立闖，李 嬌，張 倩，莊金秋，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

反向遺傳技術(shù)及其在豬病防控研究中的應(yīng)用

祖立闖1，李 嬌1，張 倩2，莊金秋3，李 峰3，沈志強1，3

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

反向遺傳技術(shù)與經(jīng)典的從表型改變到進行基因特征研究的思路相反，是指通過在體外構(gòu)建病毒的感染性cDNA克隆，通過病毒拯救獲得低毒力的弱毒株，并且新毒株的免疫原性保留，可以作為弱毒疫苗而廣泛應(yīng)用到豬病防控中，將是未來新型豬病疫苗研究的發(fā)展方向。文章針對反向遺傳技術(shù)在豬病防控中的研究概況作一簡要綜述，以期為加強我國新型疫苗研究開發(fā)和提高我國豬病防控能力提供參考。

反向遺傳技術(shù)；豬病防控；應(yīng)用

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的現(xiàn)代化、規(guī)模化快速發(fā)展，以疫苗免疫接種為主的動物疫病防控體系亦得到不斷完善，但在臨床中日益表現(xiàn)出溫和型和非典型病變，給豬病的綜合防控提出了新的挑戰(zhàn)。故加強新型疫苗尤其是基因標(biāo)記疫苗的研究日益得到重視，反向遺傳操作技術(shù)能夠利用生物信息學(xué)技術(shù)對微生物基因組序列進行分析，在對靶基因進行必要的定點突變和基因置換等加工和修飾后，再按組成順序構(gòu)建和裝配出具有生命活性的個體。與傳統(tǒng)疫苗相比，反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的新型疫苗株具有減毒途徑明確、效率高、毒力回復(fù)率低的優(yōu)勢，并且能夠通過標(biāo)記基因?qū)崿F(xiàn)與野毒株的鑒別診斷。隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，近幾年反向遺傳技術(shù)在豬病方面的研究亦得到不斷發(fā)展和深入，本文針對反向遺傳技術(shù)在豬病防控中的研究概況作一簡要綜述，以期為加強我國新型疫苗研究開發(fā)和提高我國豬病防控能力提供參考。

1　動物病毒的反向遺傳系統(tǒng)

動物病毒的反向遺傳操作通過感染性克隆的構(gòu)建，可以進一步了解病毒的基因和功能，闡明病毒的起源和致病機制，開發(fā)新型疫苗及病毒載體疫苗。突破了對單一基因研究的局限，從病毒整體與分子之間、病毒與宿主關(guān)系方面研究病毒的毒力和致病性?？梢圆扇』蚯贸?、插入、置換或構(gòu)建嵌合病毒等方法對病毒基因功能進行研究。目前動物病毒的反向遺傳操作研究的手段主要包括以T7 RNA聚合酶為基礎(chǔ)的病毒拯救系統(tǒng)、真核RNA聚合酶Ⅰ拯救系統(tǒng)、真核RNA聚合酶Ⅱ拯救系統(tǒng)、polⅠ-polⅡ雙啟動子拯救系統(tǒng)。

2　幾種主要豬病的反向遺傳操作系統(tǒng)

2.1豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)方面的研究比較多，國內(nèi)孟沙沙等［1］分別構(gòu)建了H1N1亞型豬流感病毒JS40株8個基因節(jié)段的重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染293T和MDCK混合細胞，拯救出病毒R-JS40株，序列測定結(jié)果表明，救獲病毒與親本病毒的核苷酸序列一致，無氨基酸變異，可以穩(wěn)定傳代，抗原性未發(fā)生變化，對小鼠的致病性結(jié)果顯示R-JS40與JS40對小鼠的組織嗜性以及在肺臟中復(fù)制的病毒滴度基本一致，表明R-JS40保持了親本病毒JS40的生物學(xué)特性，該病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立，為進一步開展關(guān)于病毒的致病分子基礎(chǔ)以及新型疫苗的研制提供有效的技術(shù)平臺。黃夢等［2］利用RT-PCR技術(shù)擴增豬流感病毒A/swine/ Shanghai/1/07株H1N2的8個基因片段，分別克隆至雙向轉(zhuǎn)錄表達載體PBD上，構(gòu)建出8個能在哺乳細胞中復(fù)制和表達的質(zhì)粒。將8個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，收取轉(zhuǎn)染48 h時的細胞上清液并接種9～11日齡SPF雞胚，成功拯救出有血凝活性的病毒。經(jīng)序列測定，確定拯救病毒的8個基因片段均來自豬流感病毒A/swine/Shanghai/1/07株H1N2基因。H1N2亞型豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立為豬流感病毒致病機理、傳播機制及病毒基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。同時，為H1N2亞型豬流感新型疫苗的研制開辟了新的途徑。譚力凱等［3］通過試驗構(gòu)建了包含有GDK6毒株基因的8個重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞后成功拯救出病毒rGDK6。救獲病毒與親本病毒擁有相同基因序列，其抗原性、經(jīng)HI試驗、TCID50試驗和小鼠攻毒試驗表明，救獲病毒的生物學(xué)特性與對小鼠的致病性與親本病毒一致。禽源豬流感H6N6病毒的反向遺傳系統(tǒng)的成功建立，為進一步研究H6亞型流感病毒的分子致病機理與病毒基因功能及新型疫苗創(chuàng)制提供了技術(shù)平臺。

2.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

徐彥召等［4］采用分子生物學(xué)方法改造pBluescriptIIsk（+）載體的多克隆位點并使其獲得CMV啟動子序列，在獲得該病毒的全長cDNA克隆的基礎(chǔ)上，采用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等方法將該病毒的全長cDNA置于CMV真核啟動子序列的下游，獲得含有CMV啟動子和PRRSV XX-2012株全長cDNA克隆的重組質(zhì)粒pSK-CMV-XX-2012。最后，將重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染Marc-145宿主細胞后，拯救出PRRSV XX-2012株。病毒生長特性試驗結(jié)果顯示，拯救病毒與親本病毒在Marc-145細胞上具有相似的增殖特性，且拯救病毒序列含有不同于親本病毒的分子標(biāo)記（突變產(chǎn)生的MluI酶切位點），該研究建立了一種研究PRRSV反向遺傳操作系統(tǒng)的簡單、快速、節(jié)約時間和成本的方法。李燕華［5］等在已構(gòu)建完成的高致病性PRRSV細胞傳代毒株反向遺傳系統(tǒng)（pAJXM）的基礎(chǔ)上，將T 7啟動子換成hCMV啟動子，從而全長cDNA克隆不需經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程，直接通過DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細胞拯救病毒，研究發(fā)現(xiàn)基于NDA轉(zhuǎn)染的反向操作系統(tǒng)是可行的，并且hCMV啟動子的TATA框與病毒基因組5′末端之間的堿基數(shù)目設(shè)置為25和在病毒基因組3′末端添加HDVr序列后，能夠有效地提高全長感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和穩(wěn)定性。

2.3口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

口蹄疫病毒是一種高度接觸性的烈性傳染病，它有7種血清型，病毒基因組很容易發(fā)生變異，病毒的結(jié)構(gòu)和功能尚未完全闡明，通過反向遺傳技術(shù)可以研究病毒的結(jié)構(gòu)和功能，通過體外構(gòu)建病毒感染性分子克隆，研究病毒的復(fù)制與表達調(diào)控機理，研究病毒與宿主的相互關(guān)系［6］。Li S等［7］構(gòu)建了亞洲1型口蹄疫病毒的感染性分子克隆，動物實驗證明該克隆病毒的毒力與復(fù)制動力學(xué)與親本病毒相似，該克隆病毒可以在BHK-21細胞中復(fù)制?？寺〔《救鄙?A結(jié)構(gòu)中91～104氨基酸，構(gòu)建的缺少免疫表位的FMDV突變毒株可作為滅活疫苗候選毒株，為新型弱毒疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

2.4豬圓環(huán)病毒反向遺傳操作系統(tǒng)

王偉丞［8］等參考GenBank中已發(fā)表的I型豬圓環(huán)病毒序列，設(shè)計1對特異性引物，通過PCR擴增PCV-1全長基因組序列，將其定向克隆至pcDNA3.1（+）真核表達載體中，對其進行PCR、雙酶切鑒定及DNA序列測定，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PK-15細胞中，經(jīng)3次連續(xù)傳代，用PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后盲傳細胞中PCV-1核酸，經(jīng)序列鑒定所拯救出的病毒與親本病毒核苷酸同源性100%。結(jié)果表明所構(gòu)建的PCV-1感染性克隆具有感染性。PCV-1反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立為進一步研究PCV基因組的功能及新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

3　反向遺傳操作技術(shù)在動物新型疫苗研究中的應(yīng)用前景

通過反向遺傳操作技術(shù)在新型動物疫苗研究中的不斷應(yīng)用，可以尋找出與毒力相關(guān)位點，通過對毒力決定性基因的缺失或修飾得到一種無毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗。如缺失口蹄疫病毒細胞吸附位點的編碼序列或前導(dǎo)蛋白酶的編碼序列可得到口蹄疫病毒的減毒毒株，將其作成減毒活疫苗免疫動物可獲得較好的免疫效果。另外還可以研制嵌合疫苗，開發(fā)多價疫苗。利用感染性克隆作為現(xiàn)有減毒活疫苗的種子批，可以減少生產(chǎn)批次間的差異，保持疫苗的穩(wěn)定性和安全性。總之，反向遺傳操作技術(shù)作為動物病毒病研究的一種新型方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各種新型動物疫苗研究中。當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者正在不斷致力于各種新型高效疫苗的研發(fā)，反向遺傳學(xué)的興起，極大的推動了動物病毒疫苗研究的發(fā)展方向，為動物疾病的防控起到至關(guān)重要的作用。

［1］ 孟沙沙， 喬傳玲， 陳艷， 等. 一株類禽型H1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報， 2013，35（2）： 91-94.

［2］ 黃夢， 于海， 周艷君， 等. H1N2 亞型豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立［J］.中國動物傳染病學(xué)報， 2011， 19（3）： 19-22.

［3］ 譚力凱， 張民澤， 邵振文， 等. 1 株禽源豬流感 H6N6 病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立［J］.中國獸醫(yī)雜志， 2014， 50（10）：6-8.

［4］ 徐彥召，王青，張慧輝，等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2015，45（8）：794-801.

［5］ 李燕華，韋祖樟，譚菲菲，等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒細胞傳代毒株反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（3）： 13-20.

［6］ 任方，易忠，郭會玲，等. 口蹄疫病毒反向遺傳技術(shù)研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2014，35 （11）：84-87.

［7］ Li S， Gao M， Zhang R， et al. A mutant of Asial serotype of Foot-and-mouth disease virus with the deletion of an important antigenic epitope in the 3A protein［J］. Can J Microbiol， 2011， 57（3）：169-176.

［8］ 王偉丞，曾智勇，湯德元，等. 豬圓環(huán)病毒1型反向遺傳操作系統(tǒng)的初步構(gòu)建［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（9）：124-126.

2015-10-23）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

祖立闖（1981年5月-），男，漢族，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究工作。 E-mail：zulichuang2008@126.com