熒光原位雜交技術(shù)在上尿路上皮細(xì)胞癌診斷中的應(yīng)用

易文發(fā) 曹會(huì)彥 劉智明 乜國雁 章曉東 王國錄 于 湧

(青海省人民醫(yī)院泌尿外科，青海 西寧 810007)

上尿路上皮細(xì)胞癌(腎盂、輸尿管癌)是一種較為罕見的腫瘤，年發(fā)病率(0.7～1.1)/10萬，在過去的30年略有增加。2009年我們應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)初步探討了其在中國人群中診斷膀胱癌的作用〔1〕。分子遺傳學(xué)研究表明，上尿路尿路上皮和膀胱上皮組織來源、遺傳學(xué)改變相同，應(yīng)用FISH檢測上尿路尿路上皮細(xì)胞癌在理論上是可行的〔2〕。本文探討FISH在早期診斷上尿路尿路上皮細(xì)胞癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 50例無肉眼血尿及其他泌尿系統(tǒng)疾病的正常對(duì)照組，年齡46～82(平均62.6)歲。56例疑似尿路移行上皮腫瘤的肉眼血尿患者組，男44例，年齡47～83(平均60.4)歲，女12例，年齡50～84(平均64.2)歲。所有入選病例均簽署知情同意書。

1.2 尿液留取及檢測 106例入選病例連續(xù)3 d留取晨尿200 ml，1 h內(nèi)送檢，一部分進(jìn)行FISH檢測，另一部分經(jīng)離心后制備脫落細(xì)胞玻片，由指定的經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。

1.3 FISH檢測方法 采用金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供的DNA探針。其中包括CSP3/CSP7和GLP P16/GLP P17探針，采用熒光顯微鏡檢查，均可見紅色與綠色兩種信號(hào)。GLP P16/GLP P17DNA探針常見異常類型主要為P16缺失;17號(hào)染色體呈非整倍性，正常細(xì)胞檢測結(jié)果應(yīng)為2紅2綠，異常信號(hào)主要包括:0紅 2綠、1紅 2綠、1紅 3綠及 2紅 3綠。CSP3/CSP7DNA探針常見異常表現(xiàn)為3號(hào)及7號(hào)染色體呈非整倍性，正常細(xì)胞檢測結(jié)果應(yīng)為2紅2綠，異常信號(hào)主要包括:2紅3綠、3紅2綠及3紅3綠等。

1.3.1 準(zhǔn)備探針混合物和變性 室溫下將7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和2 μl DNA探針加入微量離心管中，將其離心1～3 s。將裝有10 μl以上DNA探針混合物的試管置于(73±1)℃水浴箱變性5 min，之后，將該試管放置于45℃ ～50℃水浴箱中，在雜交前將混合物試管取出。在探針準(zhǔn)備好的同時(shí)應(yīng)將載玻片置于45℃ ～50℃烤片機(jī)上預(yù)熱。

1.3.2 探針與樣本雜交 將10 μl變性后的探針混合物滴于載玻片雜交區(qū)域后立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠將邊緣密封，隨后，將載玻片放置于提前預(yù)熱的濕盒中，在42℃保溫箱中進(jìn)行過夜雜交。

1.3.3 玻片洗滌 在室溫下將配置好的50%甲酰胺/2×(SSC)溶液(A 液)倒入三個(gè)分別標(biāo)記為“a”、“b”、“c”的考普林瓶中。注意在使用前應(yīng)將盛有溶液的考普林瓶放置于(46±1)℃水浴箱中預(yù)熱至少30 min，以使溶液達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要的溫度。然后，分別將50 ml 2×SSC溶液(B液)和2×SSC/0.1%NP洗液(C液)倒入考普林瓶中，同上，在使用前應(yīng)將盛有溶液的考普林瓶預(yù)熱至少30 min，使溶液達(dá)到所需溫度。下一步，移去蓋玻片，立即將載玻片置于“a”中，晃動(dòng)玻片1～3 s。按此步驟重復(fù)另外幾張載玻片，5～10 min后取出。然后，將載玻片置于“b”中，晃動(dòng)1～3 s，5～10 min后取出。同樣，將載玻片置于“c”中，晃動(dòng)玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。后將載玻片置于盛有B液中，晃動(dòng)玻片1～3 s，10 min后取出玻片。重復(fù)上述步驟，將載玻片置于盛有C液中，晃動(dòng)1～3 s，5 min后取出，最后，室溫浸泡在70%乙醇中，3 min后取出。

1.3.4 觀察方法 暗室內(nèi)使載玻片自然干燥，然后將5 μl DAPI復(fù)染劑滴加在雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。在暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組進(jìn)行觀察。

1.4 FISH檢測結(jié)果判定 熒光顯微鏡下觀察不典型細(xì)胞以便對(duì)玻片進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)對(duì)上述細(xì)胞中信號(hào)的數(shù)目計(jì)數(shù)。對(duì)每個(gè)樣本每種探針各分析100個(gè)細(xì)胞，如果檢測值大于閾值，則判定為陽性結(jié)果;如果檢測值小于閾值，則判定為陰性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 診斷閾值 50例正常人尿液閾值分析為:CSP3、CSP7、GLP、P16、GLP P17有1個(gè)信號(hào)點(diǎn)的細(xì)胞比例分別為:9.22%、6.76%、5.95%及6.78%;有3個(gè)及以上信號(hào)點(diǎn)的細(xì)胞比例分別為11.92%、12.64%、5.18%及7.66%。

2.2 FISH檢測的結(jié)果 以輸尿管鏡檢查和術(shù)后病理檢查為診斷標(biāo)準(zhǔn)，56例行FISH檢測的患者，通過輸尿管鏡活檢或手術(shù)后病理檢查明確診斷為上尿路上皮細(xì)胞癌患者51例，泌尿系良性病變?yōu)?例，包括輸尿管炎性病變、輸尿管結(jié)核等。

2.3 FISH在上尿路上皮細(xì)胞癌診斷中的敏感性和特異性對(duì)106例行FISH檢測的病例對(duì)于腫瘤的敏感性為91.1%，特異性為92.0%。尿脫落細(xì)胞學(xué)的敏感性為33.9%，特異性為94.0%。FISH與尿脫落細(xì)胞學(xué)在診斷上尿路上皮細(xì)胞癌中敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，特異性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

上尿路上皮細(xì)胞癌較罕見，其占尿路上皮細(xì)胞癌的5%〔3〕，目前，上尿路上皮細(xì)胞癌的早期診斷相對(duì)比較困難，其診斷方法主要依靠尿脫落細(xì)胞學(xué)、輸尿管鏡及影像學(xué)檢查。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查雖然特異性較高，但由于靈敏度低，僅為21% ～60%〔4〕，在上尿路尿路上皮細(xì)胞癌的早期診斷中的作用極為有限，此點(diǎn)在本次研究中亦有所體現(xiàn)，另外，尿脫落細(xì)胞學(xué)陽性判斷與檢驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)、水平有很大的關(guān)系〔5〕，不能提供一個(gè)較為客觀的結(jié)果。輸尿管鏡為我們提供了一種靈敏度較高的方法，但缺點(diǎn)在于其為有創(chuàng)檢查，患者痛苦，難以接受，且有可能發(fā)生輸尿管穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，限制了它的廣泛應(yīng)用，另外，輸尿管鏡檢查對(duì)原位癌的檢查陽性率極低，很難明確診斷〔6〕。影像學(xué)檢查包括泌尿系超聲、CT、MRI等檢查，雖說有一定的診斷價(jià)值，但對(duì)早期的上尿路尿路上皮細(xì)胞癌的診斷較為困難〔7〕，往往有特征性表現(xiàn)時(shí)已經(jīng)發(fā)展為中晚期，預(yù)后不佳。

FISH是比較新興的分子遺傳學(xué)技術(shù)，目前它已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因結(jié)構(gòu)、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)病毒感染分析、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析以及基因進(jìn)化研究等各領(lǐng)域。FISH檢測的主要方法是采用熒光標(biāo)記的DNA探針，依據(jù)DNA探針與被檢測樣本中DNA序列的互補(bǔ)性，將兩者雜交后在熒光顯微鏡下檢測DNA序列進(jìn)行定位、定性以及相對(duì)定量分析。此項(xiàng)技術(shù)本身操作相對(duì)簡單，重復(fù)性好、穩(wěn)定，并具有極高的敏感性和特異性。正由于FISH有上述技術(shù)特點(diǎn)及優(yōu)越性，作為一門新技術(shù)其被越來越多地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測。

本研究結(jié)果說明應(yīng)用FISH技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)改變的檢測對(duì)上尿路上皮癌的早期診斷具有良好效果，表明其靈敏度明顯高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測，而特異性則與細(xì)胞形態(tài)學(xué)相當(dāng)。FISH相比輸尿管鏡及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查具有無創(chuàng)、敏感性及特異性高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)經(jīng)過輸尿管鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果陰性而又高度懷疑上尿路上皮癌的患者來說又多了一種無創(chuàng)、簡便、高效的檢測方法。

本研究中，F(xiàn)ISH組出現(xiàn)5例假陰性，可能與腫瘤小、級(jí)別低、僅限于黏膜層致尿脫落細(xì)胞少或細(xì)胞尚未發(fā)生遺傳學(xué)改變有關(guān)〔8〕。出現(xiàn)4例假陽性，也許并不能完全排除尿路上皮癌的可能，有報(bào)道指出在11例檢查陰性而FISH檢測陽性的患者在3～12個(gè)月的隨訪中發(fā)現(xiàn)7例罹患尿路上皮癌〔9〕。說明雖然經(jīng)輸尿管鏡等檢查結(jié)果陰性而FISH陽性的患者，日后其患尿路上皮癌的風(fēng)險(xiǎn)仍很高，需密切隨診。本研究將對(duì)4例假陽性病例長期隨訪，進(jìn)一步證實(shí)其是否為尿路上皮癌高風(fēng)險(xiǎn)病例。

綜上，F(xiàn)ISH作為一種新興技術(shù)在上尿路上皮細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估中相比尿脫落細(xì)胞學(xué)顯示出其高敏感性、高特異性及無創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)。但因其探針相對(duì)價(jià)格較高，目前廣泛應(yīng)用于臨床尚有一定的難度。隨著此項(xiàng)技術(shù)的成熟及試劑成本的降低，相信FISH技術(shù)在上尿路尿路上皮細(xì)胞癌的早期診斷中將有著廣泛的臨床應(yīng)用前景。

1 曹會(huì)彥，劉智明，乜國雁，等.熒光原位雜交技術(shù)在膀胱癌診斷中的臨床應(yīng)用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(15):2809-11.

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