微小核糖核酸能否作為急性心肌損傷的未來標志物？

龍瀏城綜述，向定成審校

微小核糖核酸能否作為急性心肌損傷的未來標志物？

龍瀏城*綜述，向定成審校

心血管疾病已經成為我國的首要死因，其中急性心肌梗死（AMI）是其主要致死疾病之一。AMI救治的關鍵是早期診斷，目前公認的最佳血清標志物肌鈣蛋白也要在AMI后3.5小時才能檢測到，為了進一步提高AMI的生存率和改善預后，我們需要尋求更早的診斷標志物。微小核糖核酸（microRNA）是一種非編碼RNA分子，調節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化及凋亡，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，最近研究也表明其在AMI后血漿中的濃度有顯著變化，本文總結了最近的一些與AMI早期診斷有關的microRNA，并對microRNA作為新的AMI早期診斷標志物進行了展望。

急性心肌梗死； 微小核糖核酸；生物學標志物；早期診斷

冠心病現(xiàn)在已經成為了發(fā)達國家和發(fā)展中國家的主要死因之一。據(jù)估計我國每年死于心血管病350萬人，占總死亡原因的41%，居各種死因的首位[1]，其中急性心肌梗死（AMI）是心臟病的主要致死疾病之一。 AMI的救治要點是盡早開通梗死相關血管，挽救心肌。AMI的最佳救治時間是在發(fā)病后的2～3小時以內，我國ST段抬高的AMI診斷和治療指南中就指出“時間就是心肌，時間就是生命”，這就更加凸顯了早期診斷的重要性。目前用于AMI早期診斷最主要的血清標志物是肌鈣蛋白I/T（cTnI/T）[2]，盡管作為目前敏感性和特異性最高的血清標志物，肌鈣蛋白也要在AMI后的3.5小時才能檢測到升高，不能滿足早期診斷的需要。為了進一步提高AMI的生存率和改善預后，我們需要尋求更早的診斷標志物。近年來有越來越多的研究提供了微小核糖核酸（microRNA） 在AMI早期診斷方面的依據(jù)。

1 microRNA的生物學特征

microRNA是一類由17～25個核苷酸組成的RNA分子，不能翻譯為蛋白質，但是可以在轉錄后水平負性調節(jié)蛋白質的表達（因為其莖環(huán)結構可以與mRNA的3’-UTR配對結合，發(fā)揮負性調節(jié)作用）[3]；microRNA具有較好的保守性，在各物種中同一性較高，廣泛的參與了生物學的過程，如細胞的生長發(fā)育、分化、增值、凋亡、炎癥、損傷修復等；目前已經確定且完成測序的人類microRNA有700多個，據(jù)估計人類編碼的microRNA有1000多種，大部分存在于蛋白質編碼基因中的內含子或者兩個基因之間的獨立基因片段當中[4]。

血漿和體液中可以檢測到的microRNA有100多種，主要是由肝、肺、腎、血細胞來源的。血漿中的microRNA主要以兩種形式存在：非囊泡和囊泡形式，其中80%以非囊泡形式存在，與脂質的載體相結合，如Argonaute2蛋白（與microRNA結合后可以形成高度穩(wěn)定的復合物，甚至在細胞死亡后，還能保持穩(wěn)定，仍能在血液中檢測出來），核仁磷酸蛋白1和高密度脂蛋白[3]。

2 與急性心肌梗死相關的microRNA

心臟中存在的microRNA多達200多種，其中心肌中比較豐富的有：miR-1、miR-133、miR-499等；很多動物實驗和臨床研究都表明在AMI早期，血漿或體液中的microRNA濃度會發(fā)生變化，甚至隨著AMI的進展具有動態(tài)演變的表現(xiàn)[5-8]。因此，有可能成為未來AMI的新興標志物?，F(xiàn)就研究較多的microRNA進行介紹如下。

2.1 miR-1和miR-133：miR-1和miR-133主要存在于肌組織當中，包括平滑肌、骨骼肌和心肌，其中心肌中含量最高。miR-1有兩個亞型miR-1-1和miR-1-2（分別由MIR1-1和MIR1-2基因編碼）而miR-133有三個亞型：miR-133a-1，miR-133a-2和miR-133b（分別由MIR133A1、MIR133A2和MIR-133B編碼）。miR-133a-1和miR-133a-2有著相同的成熟序列，而miR-133b僅僅表現(xiàn)為3’末端的單個核苷酸的不同。人類基因中，MIR1-1和MIR133A2都位于20號染色體，MIR1-2和MIR133A1位于18號染色體，這兩對基因組成雙順反子共同調控和表達[9]。所以miR-1和miR-133在血液中常表現(xiàn)為類似的變化。miR-1主要參與心肌的發(fā)生和分化，在新生嬰兒心臟中可以測到高表達[10]。miR-133與平滑肌的增生相關，參與了動脈粥樣硬化的進程和心肌的纖維化[11]。

在大鼠實驗中，行冠狀動脈結扎術1小時后，miR-1就顯著增高，在6小時后達到頂峰（基礎值的200倍）。三天后，又回落到正?；€水平[7,12]。Cheng等[13]選擇小鼠尿液作為檢測標本，發(fā)現(xiàn)AMI 3小時后尿液中miR-1開始升高，并且在24小時達高峰（基礎的50倍），在7天后，尿液中miR-1的值回落至正常水平。這顯示：miR-1與AMI有著強烈的相關性，并且隨病程呈現(xiàn)動態(tài)改變，尿液中的檢測提示其可能成為一種非侵入性的檢測指標。D’Alessandra等[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠冠狀動脈結扎術后15min血漿中miR-1、miR-133a、miR-133b的濃度都明顯增高，峰值分別出現(xiàn)在18小

時、6小時、6小時，然后開始下降，出現(xiàn)與肌鈣蛋白T相似的動態(tài)改變。盡管骨骼肌中也富含miR-1、miR-133a、miR-133b，但在肢體缺血時，并不會引起血中含量的變化，提示miR-1、miR-133a、miR-133b具有一定的心肌特異性；Wang等[15]在大鼠AMI模型中，也發(fā)現(xiàn)了miR-1、miR-133a、miR-133b在AMI后的動態(tài)變化。Gidl?f等[16]在缺血再灌注的豬的模型中發(fā)現(xiàn)miR-133a在缺血后30min開始增高，在120min后達到峰值。

在臨床AMI患者的觀察研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的變化，一項17例AMI患者與33例健康對照的研究中，發(fā)現(xiàn)AMI癥狀出現(xiàn)4小時后miR-1開始上升，并且在8小時后達最高峰（達對照組的15倍），而后開始逐漸下降，這個變化曲線與肌鈣蛋白T的變化曲線相吻合[17]。在另一項67例AMI患者與32例健康對照的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)了miR-1、miR-133a的動態(tài)變化，受試者特征曲線下面積（AUC）分別為：0.8265（95%可信區(qū)間0.7441～0.9088）、0.9468（95%可信區(qū)間0.9057～0.9879）[18]。在病例數(shù)達159例的研究中與非AMI的患者相比，miR-1的水平也顯著增高，到出院時回落到了正常水平，并且miR-1的升高與年齡、性別、是否患有糖尿病無關,其區(qū)別AMI和非AMI患者的AUC值為0.774[5]。Liebetrau等[6]利用經皮室間隔化學消融術（TASH）患者作為模擬AMI患者（n=21），觀察患者miR-1、miR-133a的動態(tài)變化，15min后開始增高，分別達基礎值3倍和2.9倍，75min達到最高值，分別達基礎值60倍和50倍，也提示隨時間呈動態(tài)改變。Widera等[19]對444例ACS患者進行觀察研究,其中不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）117例，非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）131例，ST段抬高型心肌梗死（STEMI）196例。將UAP作為對照組，發(fā)現(xiàn)AMI患者（包括NSTEMI和STEMI）血中miR-1、miR-133a、miR-208a較對照組明顯升高且差異具有統(tǒng)計學意義。提示miR-1、miR-133a、miR-133b有作為新的診斷AMI標志物的可能性。 Gidl?f等[16]發(fā)現(xiàn)血中miR-1和miR-133a的水平與腎小球濾過率的相關，提示經腎臟排出，可以通過尿液檢查診斷AMI。

2.2 miR-208：miR-208主要有兩個亞型：miR-208a和miR-208b。前者是由α-心肌肌球蛋白重鏈基因（Myh6）的內含子編碼的，而miR-208b是由α-心肌肌球蛋白重鏈基因（Myh7）的內含子編碼，miR-208a參與心肌增生、傳導等功能的調節(jié)[20]。 Ji等[21]通過對359種microRNA的陣列分析，發(fā)現(xiàn)miR-208a具有高度的心臟特異性。然而 Adachi等[22]通過對人體各組織的miR陣列分析卻發(fā)現(xiàn)miR-208a和miR-208b在人體心臟中特異性不及miR-499。

Ji等[21]在用異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌損傷的實驗中，觀察到了miR-208增高，提示miR-208可反映心肌的損傷。在AMI小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，對照組（假手術組）小鼠的血中幾乎檢測不到miR-208a，而實驗組在行冠狀動脈結扎術30min后可以在血漿中檢測到miR-208a，3小時后達峰值[14]。Wang等[15]也發(fā)現(xiàn)了在大鼠AMI后miR-208a的動態(tài)演變，AMI前不能檢測到miR-208a的值，AMI后1小時達可以檢測的水平，3小時達峰值，6～12小時逐漸下降，24小時后又降到不能檢測的水平。

健康人血中的miR-208a為陰性，而在AMI患者血中miR-208a的陽性率可達90.9%[15]。在對25例STEMI患者的觀察研究中，發(fā)現(xiàn)在心肌梗死癥狀出現(xiàn)12小時后miR-208b值達對照組的3 000倍，ROC曲線下面積達到了1.0，對STEMI診斷具有很好的敏感性和特異性[16]。在不穩(wěn)定型心絞痛和AMI患者的鑒別中，miR-208a具有較好的診斷價值[19]。然而，Li等[23]在對117例AMI、182例心絞痛患者和100例健康人的研究中發(fā)現(xiàn)AMI患者血中miR-208值顯著高于正常對照，但卻低于心絞痛患者。

2.3 miR-499：miR-499也是心肌特異的microRNA，并且參與了心肌肥厚、重構等進程的調節(jié)[24,25]，健康個體中基本檢測不到。對小鼠冠狀動脈結扎模擬AMI, AMI后4小時和24小時miR-499分別增高到103倍和95倍[8]。Wang等[15]在AMI小鼠模型和AMI患者血液中也檢測到了類似的變化。在一項較大樣本量的研究中，AMI發(fā)生后，AMI患者（n=510）miR-499濃度比對照組（健康個體n=87）迅速增高了5倍以上，其中STEMI（n=397）比NSTEMI（n=113）增高明顯（P＜0.001）。胸痛癥狀出現(xiàn)3小時以內，miR-499陽性率為93%，AUC值為0.97[26]。在胸痛鑒別方面，研究表明miR-499在AMI患者顯著升高，而在不穩(wěn)定型心絞痛、慢性心力衰竭和正常對比人群中都沒有顯著變化，并且與肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）變化曲線呈正相關[22]。Corsten等[27]對比了AMI患者（n=32）和不典型胸痛患者（無冠狀動脈狹窄，n=36）的血miR-499濃度，AMI患者miR-499顯著高于對照組，達基礎值的100倍。

2.4 其他microRNA：miR-328是一種廣泛存在于人體各組織的microRNA，通過對轉錄后的調控參與了很多疾病進展，如阿爾茨海默癥、乳腺癌的耐藥、膠質瘤的惡性進展等；miR-328在AMI患者（n=57）比健康對照組有著顯著變化，但在血漿和全血中變化程度不一樣（10.9倍和16.1倍）[28]。Meder等[29]通過對AMI患者（n=20）全血進行全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)了121種在AMI后發(fā)生變化的microRNA,并確定了miR-1291和miR-663b的對鑒別AMI有著最佳的特異性和敏感性。通過對AMI患者（n=17）血漿miR-126的時間動態(tài)分析（AMI癥狀出現(xiàn)后4h、8h、12h、24h、72h、1w），發(fā)現(xiàn)AMI后血漿miR-126濃度呈下降趨勢，整體曲線與肌鈣蛋白T下降曲線近似[17]。在AMI患者（n=18）的小樣本研究中，miR-30和miR-195在AMI后都顯著升高，8小時后達峰值，let-7b則表現(xiàn)為下降，但也是在8小時達峰值，而后曲線呈下降趨勢，聯(lián)合三者計算AUC，癥狀后8小時和12小時分別為0.93、0.92[30]。

Li等[23]利用6種microRNA（miR-1，miR-134，miR-186，miR-208，miR-223和miR-499）組成一個聯(lián)合分析系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其在胸痛鑒別AMI診斷方面AUC值為0.830（95%CI，0.751～0.910）顯著高于cTnT的AUC,0.768（95%CI，0.672～0.864）和CK-MB的AUC，0.709（95%CI，0.606-0.812）；Meder等[29]利用全基因測序方法也進行了類似的研究，利用20種microRNA組成的檢驗芯片對20例AMI患者和20例對照進行檢測，這種聯(lián)合檢驗芯片對AMI的鑒別敏感度達到90%，特異性達到96%，準確性達到93%，AUC達到了0.99。

3 小結

理想的標志物應該滿足以下幾個要求：①可以通過非

侵入方式獲得所需標本；②對疾病的診斷具有高度的特異性和敏感性；③有助于早期診斷； ④能較敏感地反映疾病的動態(tài)變化情況；⑤在取樣后的標本中穩(wěn)定性好，標記物的半衰期足夠長；⑥具有快速、準確診斷的檢查手段[31]；⑦檢測手段經濟、方便。就目前的研究看，microRNA具備了其中的一些優(yōu)點：他們具有一定的組織特異性，可以穩(wěn)定的存在于血液中；可以通過序列特異性擴增（PCR）大大提高檢測的敏感性。這些優(yōu)點使得microRNA成為了新一代心臟疾病尤其是AMI快速診斷的“熱門侯選”。大量的研究證據(jù)也表明，AMI后miR-1、miR-133、miR-499等都隨時間和疾病進展有動態(tài)演變過程，但是與高敏性肌鈣蛋白相比，并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[19,26]。

因此，盡管microRNA作為AMI早期診斷標志物的前途是光明的，但是仍然缺少大樣本的研究證據(jù)，尤其是以心絞痛、肺栓塞、動脈夾層、心包炎等為對照的研究證據(jù)；另一方面，microRNA的檢測方法還有待向快速、穩(wěn)定、高效、經濟等方向發(fā)展。故其近期應用于臨床尚有困難，但這也正是未來要努力研究的方向。

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2014-05-18)

（編輯：汪碧蓉）

510010 廣東省廣州市，中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 心內科

龍瀏城 碩士研究生 主要研究方向為急性心肌梗死的早期診斷標志物 Email：jone_llc@163.com*中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學在讀研究生

向定成 Email：dcxiang@foxmail.com

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A

1000-3614（2015）01-0084-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.023