華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓亞型的流行病學(xué)調(diào)查

谷松至，許黎黎，鮑琳琳，姚艷豐，秦　川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，

國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京　100021)

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華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓亞型的流行病學(xué)調(diào)查

谷松至，許黎黎，鮑琳琳，姚艷豐，秦川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，

國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

【摘要】目的了解華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓亞型的分布和流行情況，為埃博拉病毒病的防控提供理論依據(jù)。 方法 采集華北地區(qū)動物園及養(yǎng)殖場的多種哺乳動物血清，對其進(jìn)行埃博拉病毒萊斯頓亞型的檢測。 結(jié)果 采集各種哺乳動物血清共109份，經(jīng)Real-time PCR方法檢測未檢出陽性樣品。 結(jié)論 埃博拉病毒尚未在華北地區(qū)流行，應(yīng)加強(qiáng)對埃博拉病毒病的知識宣傳，并做好安全防護(hù)工作。

【關(guān)鍵詞】埃博拉；埃博拉病毒；萊斯頓亞型；流行病學(xué)

埃博拉病毒病(ebola virus disease)又稱埃博拉出血熱(ebola hemorrhagic fever)，是由埃博拉病毒(ebola virus)引起的一種急性的、高致死率的烈性傳染病，病死率可高達(dá)90%[1]。埃博拉病毒屬絲狀病毒科，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒[2]，被WHO列為“生物危害四級”病原。2013年3月，幾內(nèi)亞首次爆發(fā)了有記錄以來最嚴(yán)重的一次埃博拉疫情，并迅速蔓延至利比里亞、塞拉利昂等西非國家[3]。截至2015年1月4日，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表數(shù)據(jù)顯示埃博拉出血熱疫情肆虐的利比里亞、塞拉利昂和幾內(nèi)亞等西非國家的感染病例(包括疑似病例)已達(dá)20747人，其中死亡人數(shù)達(dá)到8235人[4]。

根據(jù)埃博拉病毒基因的位置、順序和數(shù)量的不同，可將埃博拉病毒分為5個基因型，即扎伊爾型(EBOV)、蘇丹型(SUDV)、本迪布焦型(BDBV)、塔伊森林型(TAFV)和萊斯頓型(RESTV)[5]。埃博拉病毒萊斯頓型雖不對人致病，但可對非人靈長類有致死性，在美國和菲律賓有過猴子感染的報道[6]。而我國在2011年首次報道了從豬體內(nèi)也檢測到埃博拉病毒萊斯頓型[7]。目前我國雖尚未發(fā)現(xiàn)有感染埃博拉病毒病的患者，但不排除有埃博拉病毒隨著病毒攜帶者或引進(jìn)動物(如猴子、黑猩猩等)而進(jìn)入我國的風(fēng)險。為監(jiān)測華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓型的分布和流行情況，進(jìn)一步確定是否有存在埃博拉病毒的風(fēng)險。本研究通過采集華北地區(qū)動物園及養(yǎng)殖場的哺乳動物血清，對埃博拉病毒萊斯頓型進(jìn)行核酸檢測，以期為埃博拉病毒的防控提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品采集

2014年9月，從華北地區(qū)的動物園或養(yǎng)殖場采集猴、豬、雪貂、狗、貓等哺乳動物的血清。置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2引物合成

埃博拉病毒萊斯頓亞型的引物序列為本實驗室設(shè)計，引物序列已申請專利保護(hù)(專利號：201510014997.0)。

1.1.3主要試劑和儀器

RNeasy Mini Kit提取試劑盒購自QIAGEN公司，Superscript III First Strand Synthesis Kit試劑盒購自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，10×buffer、dNTP、Mg2+均購自TaKaRa公司，熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix，96孔0.2 mL PCR反應(yīng)管Fast Optical 96-well RXN Plate，光學(xué)反應(yīng)蓋膜96-Well Optical Adhesive Film 25PK均購自ABI公司，實時熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne系列產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用RNeasy Mini Kit提取試劑盒提取采集到的哺乳動物血清的RNA，采用Superscript III First Strand Synthesis Kit試劑盒對病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體實驗操作步驟參見說明書。合成的cDNA置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2埃博拉病毒萊斯頓亞型的Real-time PCR檢測

反應(yīng)體系為：模板2μL，dNTP 0.5μL，上、下游引物各1μL(10 pmol/μL)，10×buffer 1μL，Mg2+1μL，Ex Taq酶 0.1μL，DEPC水 8.4μL，Power SYBR Green熒光染料5μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 30 s，共35個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后讀取熒光值。

將連有埃博拉病毒萊斯頓亞型的NP gene的全長質(zhì)粒作為陽性對照。

2結(jié)果

2.1采樣情況

2014年9月，我們從華北地區(qū)的動物園或養(yǎng)殖場共采集109份血清樣品。其中恒河猴51份，豬40份，食蟹猴4份，雪貂4份，狗3份，貓2份，金絲猴2份，大熊貓1份，黑猩猩1份，環(huán)尾狐猴1份。

2.2檢測情況

對采集到的109份哺乳動物血清樣品，進(jìn)行埃博拉病毒萊斯頓亞型的Real-time PCR檢測，結(jié)果顯示，109份血清樣本全部呈陰性。

3討論

埃博拉病毒病一直被認(rèn)為是動物源性傳染病，而埃博拉病毒的自然宿主及其在自然界的循環(huán)和傳播方式尚不明確。有研究顯示，果蝠可能是埃博拉病毒的自然宿主之一。但從自然宿主直接到人類的感染很罕見，目前認(rèn)為是果蝠將埃博拉病毒直接傳染給非人類靈長類動物或人，感染病毒的非人類靈長類動物再直接傳染給人[8]。感染者可通過多種途徑傳播埃博拉病毒，而接觸傳播是最主要的傳播途徑。通過接觸患者和被感染動物的各種體液、分泌物、排泄物及其污染物感染即可感染埃博拉病毒[9]。在埃博拉疫情中，都有患者曾密切接觸過非人類靈長類(大猩猩、黑猩猩等)和其他哺乳動物(小羚羊、豬等)的尸體而被感染[10-14]。埃博拉病毒萊斯頓型不使人致病，但對非人類靈長類有致死性，且使人隱性感染[15]。在美國和菲律賓就曾在接觸過獼猴和豬的人血清中檢測出萊斯頓型埃博拉病毒抗體，并且中國和菲律賓都有豬感染萊斯頓型的報道[5,16-18]。是否存在萊斯頓型在豬體內(nèi)變異，其使人感染的潛在危險值得關(guān)注。

目前中國尚未發(fā)現(xiàn)感染埃博拉病毒的病例，但隨著我國與世界各國之間的貿(mào)易、經(jīng)濟(jì)、旅游和人員往來的日益頻繁，埃博拉病毒通過各種途徑侵入我國不無可能。尤其是外來動物(黑猩猩、猴子等)的引進(jìn)，更是提高了埃博拉病毒進(jìn)入我國的風(fēng)險。并且我國的人群無免疫力，對埃博拉病毒普遍易感。而當(dāng)前尚無有效預(yù)防和治療埃博拉病毒病的疫苗和藥物[19]。因此，在加速研發(fā)疫苗和藥物的同時，密切的對埃博拉病毒的監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查顯得尤為重要。確診埃博拉病毒病的最主要方式是病原學(xué)檢測，而傳統(tǒng)的RT-PCR檢測方法靈敏度不高、容易出現(xiàn)假陽性且不適用于大批量樣本的篩查。Real-time PCR檢測方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，在疾病暴發(fā)時可快速診斷，現(xiàn)已成為病原體檢測的重要方法。本調(diào)查對華北地區(qū)動物園及養(yǎng)殖場的各種哺乳動物進(jìn)行采樣，并對埃博拉病毒萊斯頓型進(jìn)行檢測。集中采集易感染埃博拉病毒的哺乳動物血清樣本109份，利用本實驗室針對埃博拉病毒萊斯頓型建立的Real-time PCR檢測方法對埃博拉病毒萊斯頓型進(jìn)行核酸檢測。結(jié)果顯示，所采集的血清樣本全部檢測呈陰性，表明該地尚無埃博拉病毒萊斯頓型的流行。為埃博拉病毒萊斯頓型的防控提供理論依據(jù)。雖然并未在采集到的各類哺乳動物中檢測到埃博拉病毒萊斯頓型，但考慮到采樣量和采樣次數(shù)的局限，尚需進(jìn)一步研究。

總之，在對華北地區(qū)的哺乳動物進(jìn)行埃博拉病毒病的監(jiān)測過程中并未檢測到埃博拉病毒萊斯頓型。但我們?nèi)孕枥^續(xù)開展對埃博拉病毒萊斯頓型的流行病學(xué)研究，監(jiān)測埃博拉病毒萊斯頓型在人類和非人靈長類動物及其他哺乳動物中的傳播流行規(guī)律，做到及時預(yù)警、及時控制、徹底杜絕埃博拉病毒病在人間的傳播。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pourrut X, Kumulungui B, Wittmann T,etal. The natural history of Ebola virus in Africa[J]. Microbes Infect, 2005. 7(7-8): 1005-1014.

[2]Feldmann H, Geisbert TW. Ebola haemorrhagic fever[J]. Lancet,2011,377(9768):849-864.

[3]World Health Organization. Ebola virus disease in Guinea. http://www.who.int/csr/don/2014_03_23_ebola/en.

[4]World Health Organization. Ebola Situation report. http://www.who.int/csr/disease/ebola/situation-reports/en/.

[5]LI YH, CHEN SP. Evolutionary history of Ebola virus[J]. Epidemiol Infect,2014,142(6):1138-1145.

[6]Lefebvre A, Fiet C, Belpois-Duchamp C,etal. Case fatality rates of Ebola virus disease: a meta-analysis of World Health organization data[J]. Med Mal Infect,2014, 44(9):412-416.

[7]Pan Y, Zhang W, Cui L,etal. Reston virus in domestic pigs in China[J]. Arch Virol, 2014,159(5):1129-1132.

[8]Feldmann H, Geisbert TW. Ebola haemorrhagic fever[J]. Lancet, 2011,377(9768):849-862.

[9]Breman JG, Johnson KM. Ebola then and now[J]. New England Journal of Medicine,2014,371(18):1663-1666.

[10]Peterson AT, Bauer JT, Mills JN. Ecologic and geographic distribution of filovirus Disease[J]. Emerging Infectious Diseases,2004,10(1):40-47.

[11]Vogel G. Are bats spreading Ebola across sub-Saharan Africa?[J]. Science, 2014, 344(6180): 140.

[12]Mitman G. Ebola in a Stew of Fear[J]. New England Journal of Medicine, 2014,371(19):1763-1765.

[13]Barrette RW, Metwally SA, Rowland JM,etal. Discovery of swine as a host for the Reston ebolavirus[J]. Science,2009,325(5937):204-206.

[14]Towner JS, Sealy TK, Khristova ML,etal. Newly discovered ebola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in Uganda[J]. PLoS Pathog,2008,4(11):e1000212.

[15]Bray M, Geisbert TW. Ebola virus: the role of macrophages and dendritic cells in the pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005.37(8):1560-1566.

[16]Barrette RW, Metwally SA, Rowland JM,etal. Discovery of swine as a host for the Reston ebolavirus[J]. Science,2009,325(5937):204-206.

[17]Miranda ME, White ME, Dayrit MM,etal. Seroepidemiological study of filovirus related to Ebola in the Philippines[J]. The Lancet,1991,337(8738):425-426.

[18]Centers for Disease Control(CDC). Update: Filovirus infection in animal handlers[J]. Morbidity Mortality Weekly Report,1990,39(13): 221.

[19]Cohen J. Infectious disease. Ebola vaccine: little and late[J]. Science,2014,345(6203):1441-1442.

〔修回日期〕2015-03-30

調(diào)查報告

Epidemiology investigation for reston subtype of ebola

virus in north China area

GU Song-zhi，XU Li-li，BAO Lin-lin，YAO Yan-feng，QIN Chuan

(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health; Institute of Medical Laboratory

Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models,

State Administration of Traditional Chinese Medicine; Peking Union Medicine College, Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo provide a theoretical basis for the prevention of Ebola virus disease, this survey aims to understand the distribution and prevalence status of Reston subtype of Ebola virus in north china area. Methods Collecting a variety of mammalian serums from zoos and farms in north china area, and detecting Ebola virus of Reston subtype. Results109 kinds of collected mammalian serums, there were no positive samples detected by the Real-time PCR method. Conclusion Ebola virus has not been found in north china area, we should strengthen the publicity of Ebola virus disease, and do well security work.

【Key words】Ebola；Ebola virus；Reston subtype；Epidemiology

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.017

【中圖分類號】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0071-03

[通訊作者]秦川，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail： qinchuan@cnilas.org。

[作者簡介]谷松至(1988-)，女，技師，E-mail： gusongzhi123@126.com。

[基金項目][基金項目] 國家自然科學(xué)基金(31370203)；科技重大專項—艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治(2012ZX10004501-004)；北京市自然科學(xué)基金(7142106)。