MGMT基因甲基化水平與惡性膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑耐藥性的相關(guān)性

MGMT基因甲基化水平與惡性膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑耐藥性的相關(guān)性

楊潔袁江偉王玉祥宋玉芝李娟張辛楊瓊

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療五病區(qū)，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討DNA修復(fù)蛋白6-O-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)基因甲基化狀態(tài)與惡性膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑抗腫瘤藥物耐藥性的相關(guān)性。方法選擇36例經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查確診的惡性膠質(zhì)瘤患者作為研究組，選取同期腦卒中患者10例作為對照組，比較兩組患者術(shù)前、術(shù)后腦組織中的MGMT蛋白表達水平、MGMT甲基化狀態(tài)差異，并分析MGMT甲基化與治療效果的關(guān)系。結(jié)果研究組的MGMT蛋白表達陽性率顯著高于對照組，去甲基化水平顯著高于對照組(P<0.05)。有效組16例患者，無效組20例患者，有效組MGMT蛋白表達陽性率顯著低于無效組，甲基化水平顯著高于無效組(P<0.05)。Ⅲ級患者17例，Ⅳ級19例，兩種不同病理分級患者的MGMT蛋白、MGMT啟動子基因表達率上無差異(P>0.05)。MGMT蛋白表達陽性的20例患者中僅有3例甲基化表達(15%)，MGMT蛋白表達陰性的16例患者中有14例甲基化表達(87.5%)，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態(tài)具有關(guān)聯(lián)性(χ2=18.747，P=0.000)。結(jié)論MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態(tài)呈負相關(guān)性，MGMT基因去甲基化狀態(tài)會增加惡性膠質(zhì)瘤細胞的耐藥性。

關(guān)鍵詞〔〕DNA修復(fù)蛋白6-O-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因；甲基化狀態(tài)；惡性膠質(zhì)瘤

中圖分類號〔〕R39〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省衛(wèi)生廳青年科技課題(No.20130245)

通訊作者：王玉祥(1969-),男，主任醫(yī)師，博士，主要從事惡性膠質(zhì)瘤、食管癌、肺癌等的臨床與基礎(chǔ)研究。

第一作者：楊潔(1982-)，女，碩士，主要從事惡性膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)及臨床研究。

烷化劑化療在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療中占有重要地位〔1〕。烷化劑主要通過攻擊人體細胞內(nèi)的DNA，造成DNA堿基的烷基化損傷，進而形成DNA交聯(lián)，從而導(dǎo)致細胞死亡〔2〕。DNA修復(fù)蛋白6-O-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)作為一種細胞中普遍存在的DNA修復(fù)酶，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一可以將6-O-鳥嘌呤復(fù)合物從DNA上移除的蛋白質(zhì)，可以保護染色體免受烷化劑導(dǎo)致的突變、細胞毒以及致癌作用〔3〕。本研究探討MGMT基因甲基化狀態(tài)與惡性膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑抗腫瘤藥物耐藥性的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料本研究選取我院腫瘤科2009年1月至2012年8月收治的36例經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查確診的惡性膠質(zhì)瘤患者及同期腦卒中患者10例。納入標準：惡性膠質(zhì)瘤患者均為首次入院治療、經(jīng)過手術(shù)后組織學(xué)病理檢查確診的患者(WHO分級Ⅲ、Ⅳ級)、手術(shù)前未經(jīng)過放療和化療治療、術(shù)前KPS評分>60分；腦卒中患者經(jīng)過CT或MRI證實、并經(jīng)過手術(shù)治療、不合并腫瘤。排除標準：合并身體其他部位腫瘤的患者，術(shù)前接受過放化療治療的患者。本研究共納入46例患者，研究組36例，男21例，女15例，年齡62～73〔平均(67.4±9.8)〕歲；對照組10例，男6例，女4例，年齡63～74〔平均(65.3±10.4)〕歲。兩組患者年齡、性別無差異(P>0.05)。

1.2治療方案患者均口服替莫唑胺(TMZ)，起始劑量為：每天150 mg/m2，共計5 d，停藥23 d，第1周期的治療時間為28 d。從第2周期開始，根據(jù)第1周期患者出現(xiàn)的不良反應(yīng)適當調(diào)整劑量，最大可增至每天200 mg/m2，或者降至100 mg/m2。在放療過程中密切觀察患者狀態(tài)，若出現(xiàn)腦水腫等不良反應(yīng)，應(yīng)及時使用20%的甘露醇加激素等脫水、利尿、降顱壓。每周對患者進行血常規(guī)檢測，并定期復(fù)查肝腎功能，根據(jù)檢查的結(jié)果及時應(yīng)用升血小板、白細胞或者保肝藥物。

1.3主要儀器與試劑PCR儀(美國PTC-100型PCR儀)；凝膠電泳(北京六一儀器廠)；SP廣譜試劑盒北京中山金橋生物公司；伊紅染液(臺灣BASO貝索企業(yè))；DNA純化試劑盒(上海生工生物工程公司)；濃縮型鼠抗MGMT單克隆抗體(北京中山金橋生物公司)。

1.4免疫組化法測定腫瘤組織MGMT蛋白對患者的腫瘤組織進行HE染色后免疫組化，組織蠟塊以4 μm的厚度進行連續(xù)切片后，置于60℃的烤箱進行干燥40 min；常規(guī)脫蠟至水；在3%的過氧化氫溶液室中孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫的活性，滴加一抗，并在4℃的抗?jié)窈杏诒渲羞^夜；滴加聚合物增強劑，并在室溫下孵育20 min；滴加酶標抗鼠聚合物，室溫下孵育30 min；PBS(pH7.4)沖洗3 min，沖洗3次；將PBS去除，滴加剛配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。

1.5血清MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)測定首先制備患者外周血循環(huán)DNA并將其純化，具體純化方法參照羅敏捷的研究，并加以改進〔4〕。對患者的外周血循環(huán)DNA進行甲基化處理，并進行引物序列設(shè)計，對甲基特異性PCR進行擴增，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行擴增產(chǎn)物的鑒定。

1.6結(jié)果判定MGMT蛋白陽性染色主要定位于胞質(zhì)及細胞核，染色為粉紅色。無任何染色(-)、著色極弱且難以判斷或陽性細胞≤10%者為(±)、有>10%且≤30%的著色陽性細胞(+)、有>30%的著色陽性細胞()。MGMT甲基化結(jié)果判定：MGMT-M(甲基化)或MGMT-U(非甲基化)如擴增出一條83 bp的帶者為陽性，MGMT-M陽性+MGMT-U陰性即為完全甲基化。MGMT-M陰性+MGMT-U陽性即為非甲基化。術(shù)后化療6個月療效判定：依據(jù)1979年世界衛(wèi)生組織實體瘤療效評價標準，根據(jù)CT和MRI檢查結(jié)果：分為完全緩解(CR)：所有腫瘤病灶完全消失且持續(xù)4 w以上；部分緩解(PR):腫瘤病灶體積縮小≥50%；穩(wěn)定(SD):腫瘤病灶體積增加<25%或縮小<50%；進展(PD): 腫瘤病灶體積增加≥25%或有新的腫瘤病灶出現(xiàn)?？傆行Ю龜?shù)=完全緩解+部分緩解。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0進行t及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1兩組MGMT表達及甲基化情況研究組的MGMT蛋白表達陽性率〔91.67%(33/36)〕顯著高于對照組〔10%(1/10)〕，去甲基化水平研究組〔94.44%(34/36)〕顯著高于對照組〔10%(1/10)，χ2=27.070,30.672,P<0.05〕。

2.2惡性膠質(zhì)瘤患者化療6個月后不同療效患者的MGMT表達及甲基化情況有效組16例患者，無效組20例患者，有效組MGMT蛋白表達陽性率顯著低于無效組〔12.50%(2/16) vs 90%(18/20)〕，甲基化水平顯著高于無效組〔81.25%(13/16) vs 10%(2/20),χ2=21.623,18.566,P<0.05〕。

2.3不同病理分級患者的MGMT表達及甲基化情況Ⅲ級患者17例，Ⅳ級19例，Ⅲ級與Ⅳ級患者的MGMT蛋白陽性率、MGMT啟動子基因甲基化〔35.29%(6/17) vs 47.37%(9/19),χ2=0.071,P=0.530〕差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化的相關(guān)性MGMT蛋白表達陽性的20例患者中僅有3例甲基化表達(15%)，MGMT蛋白表達陰性的16例患者中有14例甲基化表達(87.5%)，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態(tài)具有關(guān)聯(lián)性(χ2=18.747，P=0.000<0.001)。

我們應(yīng)注意到季札是將《唐風(fēng)》和堯聯(lián)系起來考慮的。 他說：“思深哉！其有陶唐氏之遺民乎？不然，何憂之遠也？非令德之后，誰能若是？”也就是說，晉國處于堯之故地，故有堯之遺風(fēng)。 若其不是故堯之遺民，則不會如此憂思之遠，不會有如此之深慮。 這又不得不對堯文化進行考察。

3討論

烷化劑藥物殺傷腫瘤細胞的機制現(xiàn)已經(jīng)非常明確，主要通過攻擊人體細胞內(nèi)的DNA，造成DNA堿基的烷基化損傷，進而形成DNA交聯(lián)，從而導(dǎo)致細胞死亡。MGMT為一種全長為769 bp的cDNA，可以保護染色體免受烷化劑導(dǎo)致的突變、細胞毒以及致癌作用。在腫瘤細胞中，MGMT分子上的2個烷基受體可以接受烷基化損傷的DNA烷基，從而修復(fù)被烷基化損傷的鳥嘌呤，阻止DNA的交聯(lián)以降低烷化劑藥物的細胞毒性作用〔5〕。但值得注意的是，MGMT只能夠修復(fù)被烷化劑藥物損傷的烷基化鳥嘌呤，但對已經(jīng)交聯(lián)的DNA卻沒有作用〔6〕。

腦膠質(zhì)瘤具有多種不同的病理類型，而MGMT對其化療效果的影響也不同。對于多形性膠質(zhì)母細胞瘤，卡莫司汀對于MGMT陽性的病人比MGMT陰性的病人化療效果差。但對于間變性星型細胞瘤，化療效果與MGMT表達關(guān)系并不密切〔7〕。MGMT基因啟動子甲基化的發(fā)生率就越低，腫瘤的惡性程度就越高〔8〕。在治療方面，在化療基礎(chǔ)上加用TMZ進行治療可以明顯改善惡性膠質(zhì)瘤患者的生存率(2年生存率為46%)，從而建立了一種惡性膠質(zhì)瘤新的治療標準〔9〕。MGMT基因作為一種可以識別惡性膠質(zhì)瘤的臨床相關(guān)性分子標記物，其基因沉默與TMZ的治療效果具有相關(guān)性〔10〕。在與腫瘤細胞耐藥性的關(guān)系研究方面，MGMT酶蛋白、酶活性以及MGMT mRNA的高低決定了腫瘤細胞對烷化劑的耐藥程度，即MGMT活性越高的細胞對烷化劑的耐藥性就越強，因此，如果能夠降低腫瘤細胞內(nèi)的MGMT蛋白水平或者酶活性就很有可能克服腫瘤細胞對于烷化劑的耐藥性。

腫瘤組織中的MGMT基因啟動因子與其血清中的含量具有顯著一致性，在檢測膠質(zhì)母細胞瘤以及非小細胞型肺癌患者的腫瘤組織以及血清中的MGMT基因甲基化水平可以發(fā)現(xiàn)，血清中的MGMT基因啟動因子甲基化與腫瘤組織具有顯著的相關(guān)性〔6〕。因此，通過檢測膠質(zhì)瘤患者血清中的MGMT基因啟動因子甲基化可以用于制定個體化的化療方案以及預(yù)測患者的預(yù)后。而本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，說明膠質(zhì)瘤患者血清中的MGMT蛋白表達高于其他非腫瘤性疾病，可以用于輔助臨床診斷。本研究顯示MGMT蛋白可以在不同類型膠質(zhì)瘤的表達上有差異，但在不同分期膠質(zhì)瘤的區(qū)分上還不夠靈敏，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態(tài)具有關(guān)聯(lián)性。

綜上，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態(tài)呈負相關(guān)性，但與病理分型無關(guān)，MGMT基因去甲基化狀態(tài)會增加惡性膠質(zhì)瘤細胞的耐藥性，因此對于沒有通過手術(shù)獲得病理診斷的患者，測定其血清MGMT蛋白與MGMT啟動子基因甲基化情況可以指導(dǎo)臨床進行個性化化療方案的選擇。

參考文獻4

1王茂德，李瑞春.腦膠質(zhì)瘤顯微手術(shù)的功能區(qū)定位意義和臨床研究進展〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013；33(22)：9828-31.

2羅敏捷，張旺明，王軍，等.惡性腦膠質(zhì)瘤MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012；11(6)：565-9.

3Kitange GJ，Mladek AC，Brett L，etal.Inhibition of histone deacetylation potentiates the evolution of acquired temozolomide resistance linked to MGMT upregulation in glioblastoma xenografts〔J〕.Clin Cancer Res，2012；18(15):4070-9.

4羅敏捷.惡性膠質(zhì)瘤組織MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)及蛋白表達與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.

5Koutsimpelas D，Pongsapich W，Heinrich U，etal.Promoter methylation of MGMT，MLH1 and RASSF1A tumor suppressor genes in head and neck squamous cell carcinoma: pharmacological genome demethylation reduces proliferation of head and neck squamous carcinoma cells〔J〕.Oncol Rep，2012；27(4):1135-41.

6史恩紅，張東利，李鵬程.MGMT表達與替莫唑胺治療多形性膠質(zhì)母細胞瘤耐藥的關(guān)系〔J〕.國際免疫學(xué)雜志，2012；35(6):453-6.

7李金磊.HIF-1α、HIF-2α在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達與研究〔D〕.沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.

8吳長松.全反式維甲酸聯(lián)合替莫唑胺對U251細胞增殖和凋亡作用的實驗研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

9黃惠勇，林洪，蘇保義，等.白藜蘆醇通過NF-κB依賴途徑下調(diào)MGMT增強膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺藥物的敏感性〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014；13(2)：114-20.

10孫健，楊學(xué)軍，楊樹源.替莫唑胺與司莫司汀治療復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤的隨機、對照、多中心研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013；93(3)：165-8.

〔2013-10-15修回〕

(編輯曹夢園)