侵襲性曲霉菌感染的診斷方法及臨床應用

侵襲性曲霉菌感染的診斷方法及臨床應用

王立朋秦榛1夏云

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶400016)

關鍵詞〔〕G試驗；GM試驗；聚合酶鏈式反應；核酸序列依賴擴增；曲霉菌

中圖分類號〔〕R44〔

基金項目：國家臨床重點專科建設項目經費資助〔財社2010(305)號〕

通訊作者：夏云(1966-)，男，主任技師，碩士生導師，主要從事感染性疾病的分子診斷研究。

1山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科

第一作者：王立朋(1989-)，男，檢驗技師，碩士，主要從事感染性疾病的分子診斷研究。

近年來由于腫瘤化療，造血干細胞移植術、實體器官移植術后應用免疫抑制劑及糖皮質激素等藥物〔1〕，臨床上出現(xiàn)越來越多的免疫力低下的老年病人并使得侵襲性曲霉菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢，免疫力低下的老年病人發(fā)生侵襲性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。在侵襲性真菌感染中，曲霉菌所導致的感染占了很大的比例，2000 ～ 2008年美國一腫瘤中心發(fā)生侵襲性曲霉菌感染的比例達58%〔2，3〕。抽樣調查顯示，空氣中存在的孢子0.1%～22%為曲霉屬孢子〔4〕。曲霉菌感染可以導致人類多種疾病，比如侵襲性曲霉病，侵襲性肺曲霉病，過敏性支氣管曲霉病，過敏性真菌鼻竇炎等。除了曲霉病以外，曲霉菌還可以導致其他多種疾病，比如曲霉腫、鼻竇炎、過敏性支氣管曲霉病等〔5〕。研究表明，某些曲霉病也可發(fā)生于一些與上述高危因素侵襲性曲霉菌感染的診斷方法及臨床應用無關的病人中，如肺曲霉病可繼發(fā)于慢性阻塞性肺病(COPD)、非真菌性肺炎等〔6〕。早期精確的診斷結果是及早開展抗霉菌治療的前提。而及時、正確的抗霉菌治療無疑能夠顯著改善臨床預后，降低死亡率。

1物理診斷

這種傳統(tǒng)的診斷方法主要是通過問診的手段獲取病人的臨床癥狀及體征。但由于侵襲性曲霉菌感染所帶來的臨床癥狀和體征缺乏特異性，并不能同其他非真菌病原體所導致的感染區(qū)分開來。并且一些重病患者往往不能或是難以準確地表達出自身的感受。根據(jù)一些臨床〔6〕經驗，長期耐抗生素性的發(fā)熱、咳嗽并伴有肋膜炎樣的疼痛對于侵襲性曲霉菌感染具有提示作用。

2影像學診斷

影像學對于侵襲性曲霉菌感染的診斷最具有價值的是高分辨率CT掃描檢查，尤其是對于肺曲霉病的診斷具有較高的參考價值。侵襲性肺曲霉病CT首次檢查的早期多表現(xiàn)為大小不等的結節(jié)，7～14 d時，結節(jié)病變的數(shù)量和大小均表現(xiàn)出增加趨勢〔7〕。肺部發(fā)生曲霉菌感染早期的CT掃描亦可出現(xiàn)光環(huán)征，隨著感染病程的發(fā)展，晚期可以出現(xiàn)新月征。CT檢查的缺點在于光環(huán)征等特征性影像出現(xiàn)的時間比較短暫，75%的光環(huán)征1 w以內就會消失〔2〕。而且并非所有曲霉菌感染病患都能出現(xiàn)特征性的CT影像；此外出現(xiàn)這兩種影像也有可能是由于其他病原微生物感染亦或是一些非感染病因引起的〔8〕。故對于CT掃描影像的提示價值應當慎重評估。

3實驗診斷

3.1顯微鏡檢查顯微鏡檢查主要包括標本直接顯微鏡檢查和組織病理學檢查,都是以形態(tài)學特點為基礎來對病原微生物進行診斷。曲霉菌鏡檢呈現(xiàn)玻璃樣透明的菌絲，但是曲霉菌菌絲結構特點的特異性并不突出，其他種類相似的真菌如青霉菌亦可呈現(xiàn)類似的鏡下特點。另一方面，組織病理學檢查報告中經常會出現(xiàn)曲霉樣形態(tài)學特點等描述性的診斷結果，這對于顯微鏡下形態(tài)學特點與曲霉菌類似但又不是曲霉菌的一些病原微生物的診斷帶來困難。由于鑒別診斷難以進行，誤診的出現(xiàn)幾乎不可避免。若是發(fā)生誤診的兩種病原微生物的治療方案相差較大，就會嚴重影響治療效果，從而進一步導致預后不良。此外，檢查者的主觀因素也有可能對診斷結論產生影響。

3.2病原微生物培養(yǎng)標本病原微生物的培養(yǎng)結果或是組織病理學診斷結論依然是侵襲性曲霉菌感染確診的“金標準”，這是曲霉菌感染的診斷基礎〔3〕。曲霉菌的培養(yǎng)適用于各種標本類型并且目前已經成熟的應用于臨床，尤其是來源于無菌部位的標本培養(yǎng)結果陽性具有確診價值。但是曲霉菌的培養(yǎng)與普通的細菌培養(yǎng)相比往往耗時更長，而且敏感性并不夠高，侵襲性曲霉菌感染早期培養(yǎng)結果通常是陰性。此外，由于曲霉菌是機會致病菌，從有菌區(qū)獲取的陽性培養(yǎng)結果并不能明確是由于定植的正常菌群或是侵襲性感染所致。

近年來，培養(yǎng)技術的改進能夠獲取比以前準確性更好的結果，并且在一定程度上可以縮短培養(yǎng)時間。但是，獲取培養(yǎng)或是組織病理檢查的標本往往要通過侵入性的檢查手段，而另一方面侵襲性曲霉菌感染通常繼發(fā)于免疫功能低下病人，這類病人很大一部分病情較重，此時侵入性檢查往往不被接受，這在一定程度上又限制了這兩種傳統(tǒng)方法的應用。

3.3臨床免疫學診斷臨床免疫學診斷主要包括曲霉菌抗原檢測及機體產生的抗體檢測。由于侵襲性曲霉菌感染者多伴有免疫缺陷，免疫功能受到削弱，機體可能并不能進行有效的免疫應答產生抗體，抗體的檢測對侵襲性曲霉菌感染的診斷意義不大，尤其是對于中性粒細胞減少病人的診斷價值更小，故臨床應用的重點在于曲霉菌抗原檢測。曲霉菌抗原檢測方法主要是(1，3)-β-D-葡聚糖(G)試驗和血清半乳甘露聚糖(GM)試驗。

3.3.1G試驗G試驗檢測的是真菌細胞壁的成分：(1,3)-β-D-葡聚糖。人體吞噬細胞吞噬真菌后能夠持續(xù)釋放該物質使得其在體液中的含量增高。(1,3)-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。該試驗適用于曲霉菌感染的診斷，但是并不能明確菌種。G試驗檢測結果陽性是歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應和感染病研究院真菌研究組(EORTC/MSG)的一個真菌感染間接標準，并且已經被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于血清樣本的檢測。G試驗能夠檢測出0.5 ng/ml的(1,3)-β-D-葡聚糖，對于急性髓性白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)病人來說有很高的準確度(敏感度97%，特異度93%)。G試驗的關鍵點在于標準化操作及臨界值的確定〔7〕。G試驗的缺點在于假陽性的存在。假陽性結果出現(xiàn)的原因主要包括以下幾個方面：血液透析和腹膜透析過程中使用纖維素膜；病人治療過程中輸入白蛋白、免疫球蛋白及凝血因子；病人服用β內酰胺類抗生素；鏈球菌引起的敗血癥；外科手術中使用的棉紗等。在評估G試驗陽性結果時，應把可能導致假陽性結果的因素排除在外。

3.3.2GM試驗主要用于侵襲性曲霉菌感染的診斷。發(fā)生曲霉菌感染時，菌絲生長時半乳甘露聚糖可以從菌絲頂端釋放入血，且釋放量與血液中的菌量呈正比，故可以間接反映感染程度。研究顯示，循環(huán)性半乳甘露聚糖敏感性在70%～90%，陽性測試結果的特異性也在70%～90%〔9〕。另有報道顯示，血清半乳甘露聚糖的檢測比臨床癥狀或是影像學檢查異常的出現(xiàn)早5～8 d。結合很有可能發(fā)生侵襲性霉菌感染的病例，分析的特異度為89%～93%，敏感度61%～71%。陽性預測值較低而陰性預測值很高，故可用于排除侵襲性霉菌感染發(fā)生的可能〔10〕。值得注意的是，血清半乳甘露聚糖連續(xù)兩次結果陽性比單獨一次的結果陽性具有更大的臨床意義，連續(xù)兩次結果陽性作為診斷標準能提供更好的準確度。為了提高診斷結果的可靠性，可以對曲霉菌感染的高危病患進行連續(xù)監(jiān)測。

與G試驗相似，GM試驗亦有假陽性結果的存在。引起假陽性結果的原因主要包括病人服用哌拉西林-他唑巴坦；病人食用的谷類食物含有GM抗原；定植的曲霉菌由于種種原因進入血液循環(huán)。在對檢測結果進行評估時，應將上述因素排除在外。總體來說，臨床免疫學診斷方法在排除影響結果的因素后，具有較大的應用價值。除血清外，其他標本類型如支氣管肺泡灌洗液等也可用于檢測。對于呼吸系統(tǒng)可能存在的曲霉菌感染，支氣管肺泡灌洗液的抗原檢查要比血清抗原檢查及支氣管肺泡灌洗液標本分離培養(yǎng)、活組織病理切片檢查的敏感性更高〔11〕。

3.4分子生物學診斷聚合酶鏈反應(PCR)分子生物學技術用于曲霉菌感染的診斷主要是及以PCR為基礎的檢測體系。PCR檢測體系的靶點主要包括曲霉菌一些基因位點的保守序列或是線粒體DNA片段。首先將標本中可能存在的曲霉菌DNA提取出來，利用實時熒光定量PCR將其擴增得出初始標本中的曲霉菌DNA拷貝數(shù)或是利用傳統(tǒng)PCR將其擴增后，利用其他分析方法對擴增后產物進行分析，從而得到初始標本中的曲霉菌的量和種類等相關信息。

PCR檢測曲霉菌感染近年來得到很多研究支持，Suarez等〔12〕應用實時熒光定量PCR技術以編碼曲霉菌28S rRNA的多拷貝基因片段為靶點進行檢測,發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR比半乳甘露聚糖檢測具有更好的靈敏度，實現(xiàn)了曲霉菌感染的進一步的提前診斷；O'Sullivan等〔13〕應用實時定量PCR技術，以編碼ITS1與ITS2保守序列及5.8 S rRNA的基因片段為靶點，對支氣管肺泡灌洗液標本進行檢測，獲得了比培養(yǎng)更好的靈敏度；Schabereiter-Gurtner等〔14〕以ITS2區(qū)域為靶點，設計具有屬特異性的引物并結合有種特異性的探針，以PCR擴增過程中出現(xiàn)的特征性的最高融解溫度，將臨床標本最常分離到的曲霉菌屬和念珠菌屬中的11個種群篩選并區(qū)別開來。

通過PCR發(fā)現(xiàn)陽性結果比CT掃描平均早1 w，比組織病理學檢查早2～3 w〔10〕。以PCR為基礎的檢測體系用于檢測曲霉菌感染的靈敏度由于靶點、標本類型的不同可能會有所差異，但報道顯示總體的靈敏度較高：Francesconi等〔15〕應用實時定量PCR對支氣管肺泡灌洗液標本進行檢測，并與半乳甘露聚糖檢測以及培養(yǎng)的方法進行對比，發(fā)現(xiàn)前兩者均比培養(yǎng)的方法更加敏感；Scotter等〔16〕報道實時熒光定量PCR檢測曲霉菌的檢測下限為100 CFU，將PCR與酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術結合以后，檢測下限可以提高到10 CFU；Bansod等〔17〕用PCR以18 S rRNA基因為靶點檢測煙曲霉菌的檢測下限達10 fg。此外，PCR檢測的特異度很高，Rantakokko-Jalava等〔18〕研究顯示PCR用于檢測煙曲霉菌的特異度可達93%。

雖然基于PCR技術的診斷方法靈敏度和特異度均比較理想，但其缺點在于污染問題和假陽性結果的出現(xiàn)。由于空氣中可能存在的霉菌孢子可能會對反應體系帶來污染，因此操作時應在超凈臺或是生物安全柜中進行。此外，此類方法仍處于研發(fā)階段，尚未出臺達成共識的標準化操作規(guī)程，進入臨床應用仍需大量研究的數(shù)據(jù)及標準操作流程。

近年來，除PCR以外，其他可用于侵襲性曲霉菌感染診斷的新方法不斷涌現(xiàn)。如Zhao等〔19〕運用核酸序列依賴擴增(NASBA)結合分子信標(MB)檢測支氣管肺泡灌洗液標本中的曲霉菌感染，檢測下限<0.1 CFU。核酸序列依賴擴增技術相比較PCR最大的不同點在于整個擴增過程在恒溫下進行，不需要高溫變性步驟，即使有外來的DNA也不會發(fā)生解鏈，再加上引物的特異識別，可有效避免PCR所存在的污染及假陽性問題；結合分子信標構成檢測體系，由于分子信標也具有一定的特異識別能力，故使得特異性得以進一步的提高，具有較好的臨床應用前景。

此外，熒光原位雜交(FISH)可以特異性地檢測出組織石蠟切片中的曲霉菌，設計不同菌屬探針進行靶DNA雜交可以快速檢測各種臨床標本中的真菌感染,根據(jù)不同種屬的曲霉菌設計出靶DNA序列特異性探針，明確曲霉菌種，以期早期病原學診斷侵襲性真菌感染(IFI)，達到搶先治療的目的〔20〕。Hsiao等〔21〕應用DNA芯片用于診斷霉菌感染的診斷，靈敏度和特異度分別達到98.3%和98.1%。斑點雜交法具有快速敏感特異的優(yōu)點對煙曲霉菌感染的快速診斷亦有重要意義〔22〕。結合目前的臨床實際狀況，臨床醫(yī)師懷疑免疫低下老年病人發(fā)生侵襲性曲霉菌感染時，應當及時多部位采集標本，并且盡可能采集多種類型的標本(如血液、支氣管肺泡灌洗液、胸腹水等)送檢，并且對于曲霉菌感染的高危病患可以1 w內多次送檢以實現(xiàn)對于感染狀況的連續(xù)監(jiān)測。如若條件允許，可以再輔以高分辨率CT掃描檢查(尤其是胸腔可能發(fā)生的真菌感染)。聯(lián)合多種方法可盡早實現(xiàn)對于曲霉菌感染的準確診斷。對于免疫力低下病人可在合適的時機采用預防性的抗曲霉菌藥物，在明確的診斷結果反饋以后再對感染的治療策略進行調整。

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〔2013-09-05修回〕

(編輯安冉冉/張慧)