豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制與轉(zhuǎn)錄模式研究進(jìn)展

王偉丞，梁海英，曾智勇，湯德元，劉 釗,代振江

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制與轉(zhuǎn)錄模式研究進(jìn)展

王偉丞，梁海英，曾智勇*，湯德元，劉 釗,代振江

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒是一種單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，有PCV1和PCV2兩種血清型，PCV1一般認(rèn)為無致病性，而PCV2是導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥的重要病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV復(fù)制模式為坩堝滾環(huán)復(fù)制，須依賴于Rep和Rep，蛋白的共表達(dá)、病毒復(fù)制起始區(qū)和雙鏈DNA片段的形成，三者缺一不可；其轉(zhuǎn)錄模式也較為復(fù)雜，可雙向進(jìn)行且通過選擇性剪切從而產(chǎn)生不同的RNA。主要對(duì)PCV2復(fù)制模式和轉(zhuǎn)錄模式等方面進(jìn)行綜述，以期為PCV的相關(guān)研究提供借鑒和參考。

豬圓環(huán)病毒；基因組結(jié)構(gòu)；復(fù)制模式；轉(zhuǎn)錄模式

豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，是一種非常小的無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒。1974年由Tisher等在PK-15細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）[1]，其在豬群中廣泛存在，一般認(rèn)為無致病性，但Saha等研究表明PCV1對(duì)豬的胚胎有一定致病性[2]。1991年，在加拿大從斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的患豬中分離到一種新病毒，該病毒與PCV1非常類似，但在抗原和基因上存在較大差異，因此被稱為豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）[3]。PCV2引起的各種疾病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。目前，該病在世界范圍內(nèi)流行，死亡率在10%～30%不等，現(xiàn)已被世界各國(guó)的獸醫(yī)和養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為本病是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后新發(fā)現(xiàn)的重要豬傳染病[4]。本文就PCV2近年來復(fù)制與轉(zhuǎn)錄模式相關(guān)研究進(jìn)行了綜述。

1??PCV2復(fù)制模式研究

PCV的基因組以坩堝滾環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制。在復(fù)制過程中，病毒首先產(chǎn)生雙鏈(DS)的復(fù)制型中間體(RF)。該復(fù)制型中間體DNA的2條鏈都能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。PCV2的復(fù)制起始區(qū)含有1個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和1個(gè)保守的八核苷酸基序A1X2T3A4X5T6↓A7C8（↓為缺口切割位點(diǎn)），這2個(gè)結(jié)構(gòu)是病毒滾環(huán)復(fù)制過程中病毒正鏈合成的起點(diǎn)[5]。研究證實(shí)，PCV2的復(fù)制起始區(qū)位于一個(gè)324 bp的片段上，該片斷位于PCV2基因組的1 635～195 bp處，在PCV2的復(fù)制起始區(qū)包含1個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、保守的八核苷酸基序、3個(gè)六核苷酸重復(fù)序列(CGGCAG)和2個(gè)五核苷酸重復(fù)序列，Rep和Rep’的共表達(dá)同樣也是起始PCV2的復(fù)制所必須的，單獨(dú)的PCV2 Rep和Rep’也不能起始PCV2的復(fù)制。用突變法對(duì)PCV2的保守八核苷酸基序進(jìn)行研究表明，PCV2復(fù)制起點(diǎn)的八核苷酸基序是病毒蛋白合成、DNA復(fù)制和子代病毒穩(wěn)定產(chǎn)生的必需核心元件[6]。滾環(huán)復(fù)制模型一般如下：

1.1?單鏈DNA變?yōu)殡p鏈DNA

單鏈 DNA病毒基因組變成雙鏈中間體并形成超螺旋作為病毒 DNA 合成的模板。這種機(jī)制和細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制相似，已經(jīng)證明只有超螺旋分子能夠作為RCR起始的模板。單鏈變成雙鏈基因組需要負(fù)鏈引物來起始新生互補(bǔ)鏈DNA的合成。在雙粒病毒和納米病毒中，負(fù)鏈引物由DNA或者是包裝在病毒中的5’端有幾個(gè)核糖核酸組成，或者是病毒感染后宿主細(xì)胞中合成的一個(gè)RNA引物。這些引物位于復(fù)制起始區(qū)或者終止序列基因間區(qū)域。但PCV負(fù)鏈基因組引物還沒有得到證實(shí)。

1.2?病毒基因組復(fù)制的起始和延伸

PCV基因組的復(fù)制要求Rep復(fù)合物和順式作用元件，在復(fù)制起始位點(diǎn)相互作用。當(dāng)Rep復(fù)合物結(jié)合到Rep和Rep’的最小結(jié)合位點(diǎn)上后，使得雙鏈超螺旋構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致環(huán)部結(jié)構(gòu)的八核苷酸基序暴露為單鏈DNA，緊接著被Rep和Rep’蛋白識(shí)別并在T6與A7之間切割。一般認(rèn)為是Rep蛋白而不是Rep’具有解開雙鏈八聚核苷酸的作用，因?yàn)镽ep蛋白含有1個(gè)解旋酶P環(huán)結(jié)構(gòu)。T6與A7之間的磷酸二酯鍵斷裂是由Rep蛋白的RC-III中的93位酪氨酸 (Tyrpe)的羥基發(fā)起親核性攻擊而導(dǎo)致的，該切割活性依賴于二價(jià)陽離子，不依賴于ATP的水解作用或回文序列[7]。在雙鏈被切開后，Rep蛋白通過自身酪氨酸磷脂鍵結(jié)合到DNA鏈5’末端，由此產(chǎn)生了一個(gè)游離的3’—OH末端。接著由宿主的DNA聚合酶以新形成的3’—OH末端作為引物單向起始新DNA合成及延伸。體外研究表明Rep蛋白和Rep’蛋白都能通過酪氨酸殘基切割斷裂八核苷酸并共價(jià)結(jié)合到移位的DNA上?，F(xiàn)已明確介導(dǎo)切割作用的分子就是共價(jià)結(jié)合到移位的DNA上，但還沒有直接的證據(jù)詳細(xì)說明是Rep蛋白還是Rep’蛋白能夠在PCV基因組起始位點(diǎn)結(jié)合并介導(dǎo)DNA切割。

新產(chǎn)生的 3’-OH 末端作為第1輪 DNA合成的引物。Rep 和Rep’蛋白都沒有聚合酶的作用，初期 DNA的延伸合成是由宿主細(xì)胞內(nèi)酶分子來主導(dǎo)完成的。如果超螺旋構(gòu)像對(duì)PCV基因組復(fù)制的起始是必須的，那么處于復(fù)制中的基因組將不能起始另一輪DNA的復(fù)制，直到第1輪基因組合成完成。

1.3?病毒基因組復(fù)制的終止

目前關(guān)于PCV前導(dǎo)鏈合成精確的終止機(jī)制還沒有確定，現(xiàn)有2種可能的機(jī)制。

1）當(dāng)新生DNA鏈完全合成及親本DNA鏈完全被替代時(shí)，Rep蛋白復(fù)合物中的Rep’蛋白在模板鏈T6與新生DNA鏈的A7之間切割，之后Rep’蛋白共價(jià)結(jié)合到新生DNA鏈5’末端，從而形成了親本鏈游離的3’-OH末端。這次親核性攻擊導(dǎo)致了親本環(huán)狀單鏈DNA的釋放，并形成了帶有Rep，蛋白共價(jià)結(jié)合的新生DNA鏈。隨后新生鏈的3’-OH末端對(duì)含有Rep’蛋白的新生DNA鏈5’端發(fā)起親核性攻擊，從而重新形成八聚核苷酸并釋放Rep復(fù)合物和含一條新生鏈的雙鏈復(fù)制中間體DNA。利用該機(jī)制終止所形成的雙鏈復(fù)制中間體DNA分子存在一不相容的回文結(jié)構(gòu)，并永不能再與Rep蛋白復(fù)合物共價(jià)。

2）如果第1輪DNA合成之后越過切割位點(diǎn)，那么這種終止的機(jī)制則與pT181質(zhì)粒的滾環(huán)式復(fù)制終止模型相似。在該機(jī)制中Rep復(fù)合物可能會(huì)進(jìn)行2次分開的切割/連接作用(先是Rep’蛋白再是Rep蛋白)，結(jié)果產(chǎn)生一條單鏈環(huán)狀親本DNA，一條含新生鏈的雙鏈中間體DNA及一含約10～12個(gè)核苷酸序列的Rep復(fù)合物（SP-Rep 蛋白復(fù)合體）。由于Rep蛋白和Rep’蛋白都能在回文序列缺失的情況下執(zhí)行切割功能，所以在反向重復(fù)序列錯(cuò)配情況下，仍然可以進(jìn)行切割作用，但是釋放的親本單鏈DNA為線狀且與Rep復(fù)合物共價(jià)結(jié)合。由此形成的雙鏈中間體DNA分子還有功能，而且如果新生DNA鏈恢復(fù)了正確的序列配對(duì)，那么該雙鏈中間體DNA分子可以在接下來的DNA復(fù)制中產(chǎn)生有活力的基因組。該機(jī)制可以充分說明含有錯(cuò)配互補(bǔ)重復(fù)序列的雙鏈PCV基因組質(zhì)粒能夠產(chǎn)生有活性的子代病毒。

2??PCV2轉(zhuǎn)錄模式研究

PCV基因組的轉(zhuǎn)錄模式非常復(fù)雜。轉(zhuǎn)錄是雙向進(jìn)行的并且通過選擇性剪切產(chǎn)生不同的RNA。PCV1和PCV2的轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)在基因組上的位置相當(dāng)，但是它們?cè)谔囟≧NA表達(dá)水平及剪切點(diǎn)選擇上有所不同。己有報(bào)道，在PK-15細(xì)胞的病毒復(fù)制過程中，PCV1編碼13種RNA，包括1個(gè)衣殼蛋白 RNA、8個(gè)Rep 相關(guān) RNA (分別 為 Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b、Rep3c-1、Rep3c-2、Rep3c-3、Rep3c-4)、3個(gè)NS相關(guān)RNA (分別為NS462、NS642、NS0)及ORF3-RNA；而PCV2編碼10個(gè)RNA，分別為1個(gè)衣殼蛋白R(shí)NA、5個(gè)Rep相 關(guān) RNA (分 別 為 Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b、Rep3c)、3 個(gè) NS 相關(guān) RNA(分別為NS515、NS672、NS0)及ORF3-RNA，其中Rep相關(guān)RNA擁有相同的5’端和3’端核苷酸序列，這可能說明這些RNA是從全長(zhǎng)Rep基因中通過選擇性剪切而形成的[9]。Rep相關(guān)RNA與NS相關(guān)RNA的3’端核苷酸序列也相同。通過基因組分析比較發(fā)現(xiàn)，PCV1和PCV2的Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b和NS0基本上相同，但是Rep3c及NS相關(guān)RNA卻因剪接點(diǎn)不同而在數(shù)量上和性質(zhì)上有所差別，突變結(jié)果表明，Rep和Rep’是病毒復(fù)制必須的蛋白。

編碼的復(fù)制酶蛋白、病毒衣殼蛋白及凋亡相關(guān)蛋白功能已進(jìn)行了鑒定，但這些較小的RNA能否編碼蛋白及它們?cè)诓《旧h(huán)中的功能尚不明確。ORF1經(jīng)不同的剪輯，編碼2個(gè)病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，Rep和Rep’，Rep和Rep’蛋白與基因間區(qū)域5’端復(fù)制原點(diǎn)內(nèi)的特異性序列結(jié)合，為病毒復(fù)制必需的。ORF2編碼病毒的Cap蛋白，與病毒和宿主細(xì)胞受體結(jié)合有關(guān)。Cap蛋白包裹單股環(huán)狀病毒基因組形成感染性的病毒粒子，并將在復(fù)制酶蛋白R(shí)ep和Rep’從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核進(jìn)行病毒DNA復(fù)制起重要作用，PCV2衣殼蛋白是病毒主要的免疫原蛋白，是疫苗研發(fā)和PCV2特異性血清學(xué)診斷的靶蛋白。此外，ORF3編碼的相關(guān)蛋白具有一定的致病性，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。

3??結(jié)語

PCV2是嚴(yán)重的免疫抑制性疫病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害。近年來對(duì)PCV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)理相關(guān)研究成為熱點(diǎn)，也取得了很多成就，但關(guān)于PCV基因組復(fù)制過程中Rep’蛋白具體的生物學(xué)功能，PCV負(fù)鏈基因組的引物，宿主細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白如何被激活、記憶、復(fù)制、終止的確切機(jī)制等仍需深入和系統(tǒng)的研究，以期為抗PCV的藥物的開發(fā)及疫苗的研制提供更多重要的理論依據(jù)。

[1] Tischer I，Rasch R，Tochtermann G.Characterization of papovavirusand picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines [J]. Zentralbl Bakteriol Orig A，1974，226(2)： 153-167.

[2] Saha D，Lefebvre D J，Ducatelle R，et al. Outcome of experimental porcine circovirus type 1 infections in mid-gestational porcine foetuses [J]. BMC Vet Res，2011（7）： 64.

[3] Allan G M，Mcneilly F，Kennedy S，et al. Isolation of porcine circoviruslike viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe [J]. J Vet Diagn Invest，1998，10(1)： 3-10.

[4] 王憲文，姚四新，王麗榮，等. 豬圓環(huán)病毒Ⅱ型流行病學(xué)新特點(diǎn)及致病機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39(12)： 190-194.

[5] Cheung A K. Porcine circovirus：Transcription and DNA replication [J]. Virus Res，2012，164(2)：46-53.

[6] Cheung A K.Identification of an octanucleotide motif sequence essential for viral protein，DNA，and progeny virus biosynthesis at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 2[J].Virology，2004，324(1)：28-36.

[7] Steinfeldt T，F(xiàn)insterbusch T，Mankertz A. Functional analysis of cis- and trans-acting replication factors of porcine circovirus type 1[J].J Virol，2007，81(11)：5696-5704.

[8] 李鵬，王利平，朱艷平，等. 豬圓環(huán)病毒2型靶細(xì)胞及其受體的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40(1)： 25-28.

2014-03-28）

“攜帶遺傳標(biāo)記的豬圓環(huán)病毒反向遺傳操作平臺(tái)的構(gòu)建”[黔科合LH字（2014）7670]；貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目“貴州省規(guī)?；i場(chǎng)豬繁殖障礙性疫病防控體系的研究與示范”[黔科NY(2010)3042]

王偉丞（1990—），男，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)。

曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究。