ELISA檢測孔雀石綠的體會(huì)

[摘 要] 作者簡述了孔雀石綠的ELISA檢測方法、經(jīng)驗(yàn)及關(guān)鍵環(huán)節(jié)的注意事項(xiàng)，為實(shí)驗(yàn)室檢測人員提供參考。[關(guān)鍵詞] 孔雀石綠 ELISA檢測方法

作者簡介：齊海霞（1973－），高級獸醫(yī)師，從事實(shí)驗(yàn)室管理及檢測。

1　孔雀石綠概述及危害

孔雀石綠是人工合成的有機(jī)化合物，它既是殺真菌劑，又是染料，易溶于水，溶液呈藍(lán)綠色?？兹甘G進(jìn)入人類或動(dòng)物機(jī)體后，可以通過生物轉(zhuǎn)化，還原代謝成脂溶性的無色孔雀石綠，具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變作用，嚴(yán)重威脅人類身體健康。所以，我國于2002年將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動(dòng)物。

2　檢測方法

當(dāng)前，水產(chǎn)品中的孔雀石綠殘留檢測方法有四種。即快速檢測、ELISA檢測、高效液相色譜法檢測、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。其中孔雀石綠ELISA檢測方法所需物品少且出現(xiàn)結(jié)果快，檢測成本相對較低，檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確，較適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室檢測，是最合適的初篩方法。

3　孔雀石綠ELISA檢測方法

3.1 樣品前處理

（組織樣品：魚、蝦樣品；稀釋倍數(shù)：1.5；添加T：0.5ppb）

（1）勻質(zhì)無骨樣品至粉碎均勻（糊狀），-20℃保存。

注意：最好提前勻質(zhì)，因?yàn)闃悠焚|(zhì)量較少，加液后勻質(zhì)會(huì)導(dǎo)致?lián)p失過多。

（2）準(zhǔn)確稱取2g勻質(zhì)好的樣品，加入1ml 1x樣品提取液A，0.4ml 1x樣品提取液B，加入6ml乙腈后，最大速度渦旋振蕩4min或者振搖20 min。

注意事項(xiàng)：

A、樣品提取液A比較難溶解，需提前配制，且攪拌時(shí)間較長。

B、先加樣品提取液A、B后渦旋至組織分散，再加入乙腈渦旋。乙腈會(huì)讓組織抱團(tuán)，致使組織分散障礙，無法達(dá)到混合均勻的目的。

（3）室溫（22.5±2.5）℃下轉(zhuǎn)速4000rpm離心10min后，取2 ml上層有機(jī)液到另一新離心管中，該離心管中應(yīng)先加入300mg的純化試劑，最大速度渦旋振蕩1min后，室溫（22.5±2.5）℃下靜置10min。

注意：需先稱量純化試劑再加上層有機(jī)液；確保靜置時(shí)間，不宜縮短，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（4）室溫（22.5±2.5）℃下轉(zhuǎn)速4000rpm離心10min。

（5）取1ml上清液到一干凈離心管中，通過平行蒸發(fā)或者氮?dú)獯蹈桑?0℃～60℃水?。?。

注意：乙腈吹到完全干燥，但不宜時(shí)間過久，1ml液體基本吹干需半小時(shí)左右，視具體情況而定。

（6）加入100μl 的1x 氧化劑液到吹干的樣品管中，渦旋振蕩1min后，室溫（22.5±2.5）℃下轉(zhuǎn)速4000 rpm離心1min后，室溫下靜置15min。

注意：氧化劑液配制需用乙腈稀釋；離心1min不可省略，靜置時(shí)間不可縮短。

（7）加入400μl的1x樣品提取液C到樣品中。

（8）加入650μl的正己烷到樣品中，渦旋振蕩1min后，室溫（22.5±2.5）℃下最大轉(zhuǎn)速離心5min。

注意：最大轉(zhuǎn)速以離心機(jī)為準(zhǔn)，可用10 000rpm，如無法達(dá)到可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速。

（9）棄除上層有機(jī)溶液，每孔取出90μl下清液，即可進(jìn)行樣品檢測。

注意：棄除上層有機(jī)溶液及雜質(zhì)的同時(shí)，盡量多的保留下清液，以免點(diǎn)板時(shí)由于樣品液過少而無法做平行。

注：前處理所需儀器為天平、勻質(zhì)器、離心機(jī)、渦旋儀、平行蒸發(fā)儀或氮吹儀。

3.2 樣品上機(jī)

注意事項(xiàng)：檢測步驟中所用酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品等需提前回溫1～2h；超過1個(gè)月不使用的試劑盒，需將100xMG-生物素耦合物以及標(biāo)準(zhǔn)品冷凍保存。

（1）分別加入90μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品于對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔中。

注意：標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均需做平行，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（2）在每孔中加入30μl 1xMG-生物素耦合物，輕敲微孔板邊緣混勻1min。

注意事項(xiàng)：1xMG-生物素耦合物按1：99比例配置，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）室溫（22.5±2.5）℃下避光孵育30min。

（4）洗板：洗板3次，每次應(yīng)該加入250μl 1x洗液，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干。

注意事項(xiàng)：拍干的板不宜有氣泡，如有氣泡應(yīng)用干凈槍頭戳破；拍干板后應(yīng)馬上加入下一步反應(yīng)的液體，避免板過干，影響檢測效果。

（5）每孔加入100μl的1x辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素，室溫（22.5±2.5）℃下避光孵育15min。

注意事項(xiàng)：1x辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素按1：99比例配置，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

（6）洗板：重復(fù)（4）過程一次。

（7）加入100μl TMB底物，輕輕混勻1min，室溫（22.5±2.5）℃下避光孵育10～15min.

（8）加入100μl的終止液終止反應(yīng)，在450nm下讀OD值。

雖然孔雀石綠ELLSA檢測方法步驟繁多，但是只要注意到這些細(xì)節(jié)，檢測結(jié)果還是相對準(zhǔn)確的。

4　使用ELISA試劑盒檢測的注意事項(xiàng)

（1）檢測步驟中所用酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品等需提前回溫1～2h。

（2）勻質(zhì)應(yīng)盡量完全，呈糊狀。

（3）需振搖混勻時(shí)，如用振蕩器混勻，振蕩時(shí)間相比渦旋儀應(yīng)適當(dāng)延長。

（4）離心后吸取上清液時(shí)，應(yīng)注意按照吸取的液量選擇合適量程的加樣器，避免因加樣器不合適而吸取到下層有機(jī)液。

如：上清液需要1～4ml時(shí)，均使用1ml的加樣器，可增加吸取次數(shù)，但切勿使用5ml的加樣器吸取上清液。

（5）氮?dú)獯蹈汕?，?yīng)先潤洗針頭；放入樣品開始氮?dú)獯蹈桑?/p>

（下轉(zhuǎn)第38頁）