豬附紅細(xì)胞體病的診斷技術(shù)綜述

文│牛藝儒 杜娟 左光大 史貴麗（山西省長(zhǎng)治市畜牧獸醫(yī)局）

附紅細(xì)胞體?。╡perythrozoonosis，簡(jiǎn)稱(chēng)附紅體?。┦怯筛郊t細(xì)胞體（Eperythrozoon，簡(jiǎn)稱(chēng)附紅體）引起的一種人畜共患傳染病，以貧血、黃疸、發(fā)熱為特征。該病最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)20年代，直到1950年確定豬的黃疸性貧血是由附紅體引起的，這樣才逐漸被人們重視起來(lái)。研究表明，目前，該病已廣泛分布于世界許多國(guó)家和地區(qū)，在對(duì)人類(lèi)造成一定影響的同時(shí)，也給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)損失。

一、病原特性

由于附紅體在多種動(dòng)物身上均可見(jiàn)，在不同動(dòng)物中寄生的各有其名，寄生在豬身上的稱(chēng)為豬附紅體（E.suis）和小附紅體（E.parvum）。光鏡下，豬附紅細(xì)胞體呈環(huán)形、球形、卵圓形以及桿狀等多種形態(tài)，它們多在紅細(xì)胞表面成團(tuán)或單獨(dú)寄生，也有的在血漿中呈游離狀態(tài)，被附紅體寄生后的紅細(xì)胞呈多種形態(tài)。

附紅體對(duì)苯胺色素易著色，革蘭氏染色陰性，姬姆薩染色呈紫紅色，瑞氏染色呈淡藍(lán)色。Gulland等用掃描及透射電子顯微鏡，觀察到有豬附紅細(xì)胞體感染的病豬，附紅細(xì)胞體寄生的紅細(xì)胞呈凹陷球狀或短桿狀。

附紅體對(duì)干燥和化學(xué)藥物比較敏感，0.5%苯酚37℃經(jīng)過(guò)3小時(shí)即可殺死，一般常用的消毒劑在幾分鐘內(nèi)即可致其死亡。但它對(duì)低溫冷凍的抵抗力較強(qiáng)，可在低溫下存活數(shù)年之久。

附紅體是條件性致病菌，有特異性，在機(jī)體抵抗力低下或處于某些應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，豬附紅體感染率上升，甚至引起發(fā)病。

二、臨床癥狀

該病常感染率極高，豬附紅體寄生于紅細(xì)胞或者游離于血漿中，任何年齡段的豬均可發(fā)病，并且容易與其他疾病混合感染，多數(shù)情況下呈隱性經(jīng)過(guò)。急性黃疸、高熱、貧血為該病的主要臨床特征，潛伏期不定，平均為7天左右。

不同階段的豬感染附紅細(xì)胞體后主要臨床癥狀如下：新生仔豬和斷奶仔豬的發(fā)病率和死亡率都比較高，早期癥狀為發(fā)熱，體溫高達(dá)40℃以上，皮膚發(fā)紅，食欲不振或者廢絕，精神沉郁，貧血、虛弱，康復(fù)后的仔豬常生長(zhǎng)發(fā)育停滯。育肥豬生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重消瘦，抵抗力下降，容易感染其他疾病。母豬發(fā)病后繁殖障礙，生殖能力下降，出現(xiàn)不發(fā)情、受胎率降低、流產(chǎn)和死胎等癥狀。慢性感染的豬極度消瘦，皮膚蒼白，呼吸困難，生長(zhǎng)緩慢，接近停滯。血液學(xué)檢查可見(jiàn)紅細(xì)胞數(shù)減少，血紅素下降，血漿白蛋白、β球蛋白、γ球蛋白均下降，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞上升等。病程長(zhǎng)短不一，短者幾天，長(zhǎng)者數(shù)月，甚至數(shù)年，嚴(yán)重者死亡。

三、診斷研究

根據(jù)臨床表現(xiàn)可做出初步判斷，確診需做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.直接鏡檢。這種方法仍是診斷該病的主要手段。采集病豬的靜脈抗凝血，滴1滴于載玻片上，加入等量生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)靹蚝笊w上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察其形態(tài)，患病的可見(jiàn)紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，邊緣不整齊呈多種形態(tài)。附紅體聚集于紅細(xì)胞表面，數(shù)量不等，運(yùn)動(dòng)狀態(tài)也不同，形態(tài)常呈桿狀、環(huán)形、球形、逗點(diǎn)形、卵圓形、不規(guī)則形狀等。

由于附紅體對(duì)苯胺易于著色，因此可以用不同染液進(jìn)行染色后觀察判斷。

2.電鏡觀察。在掃描電鏡下，可見(jiàn)附紅體呈大小不等的球形、卵圓形、桿狀等多形態(tài)，附有附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞呈星芒狀或不規(guī)則的多邊形，紅細(xì)胞膜產(chǎn)生凹陷、變形。在透射電鏡下，附紅體大小不等，呈多球性小體，并且可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)狀的纖毛，無(wú)細(xì)胞壁、細(xì)胞器和細(xì)胞核，僅有單層限制膜包裹。該病不同的感染形式或處于不同階段的發(fā)病過(guò)程，其形態(tài)也可能不相同。

婁紅軍等在4580倍掃描電鏡下，在紅細(xì)胞表面可觀察到有大小不一鏈球狀、桿狀附紅細(xì)胞體附著，紅細(xì)胞呈波浪形。在透射電鏡12000倍下觀察，附紅細(xì)胞體為一近似球形結(jié)構(gòu)物，邊緣密度較中間密度大，附著點(diǎn)有纖絲狀物與紅細(xì)胞相連。

3.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）。該方法是在1958年由Splitter首次用于對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的診斷，這種方法對(duì)于診斷急性病例效果較好。在臨床上，發(fā)病后的第三天，血清檢查呈陽(yáng)性，2～3周后逐漸轉(zhuǎn)為陰性，對(duì)于慢性帶菌豬一般呈陰性反應(yīng)。Schuller W.等運(yùn)用CFT對(duì)人工感染附紅細(xì)胞體病的豬血液中的抗體滴度進(jìn)行了檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體滴度變異較大，因此，該方法只適合于對(duì)豬群的檢測(cè)，而對(duì)少量的豬的檢測(cè)效果并不理想，即此方法不適用于對(duì)個(gè)體進(jìn)行診斷。

4.間接血凝試驗(yàn)（IHA）。Smith等于1975年首次建立了用間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的抗體，并把抗體滴度為1∶40作為該病為陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，這種方法靈敏度高，可檢測(cè)出CFT反應(yīng)轉(zhuǎn)為陰性的耐過(guò)豬。張守發(fā)等采用不同動(dòng)物的紅細(xì)胞經(jīng)醛化、鞣酸化后致敏，也取得了較好的效果。目前，應(yīng)用IHA研究人工感染豬附紅細(xì)胞體病是一種常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，這種方法在一定程度上可以檢測(cè)出潛在感染的病豬。

5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。1996年Lang等人用除去紅細(xì)胞的綿羊附紅細(xì)胞體抗原對(duì)羊進(jìn)行ELISA檢測(cè)，并認(rèn)為這種方法比IHA的敏感性高8倍。他們認(rèn)為用這種方法檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的敏感性要高于IHA法，并且特異性較好，不與豬和牛的其他疾病發(fā)生交叉反應(yīng)，然而這種方法不適合用于對(duì)小豬及公豬的診斷，也不適用于該病急性期的診斷。Hoelzle L.E.等對(duì)豬附紅細(xì)胞體的血清學(xué)診斷方法進(jìn)行了改進(jìn)，用間接ELISA和免疫雜交試驗(yàn)法進(jìn)行診斷，檢出率為100%。

6.間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）。這種方法最早用于診斷牛附紅細(xì)胞體病，在接種的第四天抗體首次出現(xiàn)，之后，隨著病原的增多，到第二十八天時(shí)達(dá)到高峰，而這種方法也比血液涂片法敏感很多。韓一超等采用這種方法，對(duì)部分規(guī)?；i場(chǎng)和養(yǎng)豬戶(hù)的豬進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和診斷，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在隱性感染的豬群中，IFAT方法診斷的陽(yáng)性率比直接鏡檢的高出11.2個(gè)百分點(diǎn)，并且差異顯著。因而，這種方法也可以用于對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的診斷檢查。

7.分子生物學(xué)技術(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛運(yùn)用，自上世紀(jì)末開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于動(dòng)物附紅細(xì)胞體分子診斷方法的報(bào)道，主要有以下幾種：

（1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR特點(diǎn)是可將單拷貝的靶序列放大百萬(wàn)倍，該方法的優(yōu)點(diǎn)就是靈敏性高。在臨床上，既可以檢測(cè)出急性感染的病例，同樣也可檢測(cè)出隱性感染的，并且檢測(cè)快速、特異性好，因此，這是一種敏感、有效的豬附紅細(xì)胞體病原確診方法，主要用于種原鑒定。

Gwaltney S.M.等首次使用PCR方法檢測(cè)純化的豬附紅細(xì)胞體感染的豬的組織和血液，擴(kuò)增結(jié)果表明這種方法敏感性更高，更加快速，特異性也更強(qiáng)，并且這種方法同樣適用于診斷血液中少量附紅細(xì)胞體的慢性感染的病豬。Hoelzle L.E.等將純化后的豬附紅細(xì)胞體基因組酶切后獲得一段短片段，根據(jù)該片段設(shè)計(jì)引物建立PCR方法，對(duì)有明顯臨床癥狀的豬和處于潛伏期的豬進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法是檢測(cè)陰性感染附紅細(xì)胞體動(dòng)物的一種好方法。

國(guó)內(nèi)研究者使用此方法對(duì)該病的研究起步較晚，但發(fā)展迅速，相繼建立了各種動(dòng)物的附紅細(xì)胞體病的PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明該方法敏感性高、特異性好、快速、準(zhǔn)確，可以對(duì)豬附紅細(xì)胞體病進(jìn)行病原學(xué)診斷和研究。

（2）熒光定量PCR方法（FQPCR）。閆若潛等經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，成功建立了豬附紅細(xì)胞體的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，比較發(fā)現(xiàn)該方法比普通PCR靈敏度高100倍，并且特異性也高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率也高，較普通方法檢出的陽(yáng)性率也高。朱紹輝等在國(guó)內(nèi)首次建立了SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體，結(jié)果表明該方法有較好的特異性、敏感性和廣譜性，從而為豬附紅細(xì)胞體病的臨床診斷檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

（3）DNA探針技術(shù)。該方法的優(yōu)勢(shì)在于特異性強(qiáng)，而缺點(diǎn)是敏感性較低，尤其是在輕度感染時(shí)檢出率很低，基本上等同于鏡檢的水平。Oberst R.D.等從基因文庫(kù)中克隆出一段序列KSU-2作為探針，可用于鑒別診斷感染豬與隱性感染豬血樣。另外，該探針與犬、馬、牛、貓等血樣DNA之間不發(fā)生雜交，但這種方法敏感性較低，不適合于豬附紅細(xì)胞體病的早期診斷。

四、展望

從20世紀(jì)中期豬附紅細(xì)胞體病發(fā)現(xiàn)至今，該病已成為一種日益嚴(yán)重的人畜共患病。近年來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)開(kāi)始發(fā)生此病，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，從而使人們開(kāi)始對(duì)此病加強(qiáng)了關(guān)注。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于該病的研究還不是很深入，尤其是國(guó)內(nèi)，雖然許多研究者已經(jīng)建立了許多免疫學(xué)和分子生物學(xué)的診斷方法，且這些方法也比常規(guī)方法特異性好，敏感、高效，但也存在諸多不便于操作、試劑昂貴、無(wú)統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)等亟待解決的問(wèn)題，對(duì)于國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的流行情況沒(méi)有很好的掌握，因此，隨著對(duì)附紅細(xì)胞體病研究的深入，有必要首先對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的流行情況了解，逐步建立實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型，運(yùn)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)而開(kāi)發(fā)用于治療該病的疫苗，相信在不久的將來(lái)很有可能有效控制附紅細(xì)胞體病的發(fā)生和傳播，從而促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。