新生兒高膽紅素血癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展

楊 李，吳 德，唐久來(lái)

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒神經(jīng)康復(fù)中心，合肥 230032）

新生兒高膽紅素血癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展

楊 李，吳 德，唐久來(lái)

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒神經(jīng)康復(fù)中心，合肥 230032）

目前多種方法可建立新生兒高膽紅素動(dòng)物模型，如通過(guò)腹腔或靜脈注射膽紅素方法、利用基因缺陷動(dòng)物模型、利用注射化學(xué)藥物特殊的作用，以及延髓直接注射膽紅素的方法等，為更好的利用動(dòng)物模型進(jìn)行高膽紅素血癥及所導(dǎo)致的核黃疸、聽(tīng)覺(jué)障礙等的病因、發(fā)病機(jī)制及治療的研究，本文對(duì)新生兒高膽紅素血癥各類動(dòng)物模型構(gòu)建方法、應(yīng)用和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為新生兒高膽紅素血癥模型的研究提供參考。

新生兒高膽紅素血癥；模型，動(dòng)物

新生兒高膽紅素血癥是新生兒時(shí)期最為常見(jiàn)的疾病，新生兒由于其自身代謝特點(diǎn)，出生后紅細(xì)胞破壞增加致膽紅素生成增多、肝細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)化代謝能力不足和新生兒自身腸肝循環(huán)，導(dǎo)致高膽紅素血癥［1］；膽紅素具有神經(jīng)毒性，輕度升高，即可導(dǎo)致患兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，達(dá)到一定濃度時(shí)，可發(fā)生核黃疸，導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)障礙、智力低下，腦性癱瘓等嚴(yán)重后遺癥［2］。

動(dòng)物模型應(yīng)盡可能模擬出疾病的特點(diǎn)、病理生理機(jī)制，目前高膽紅素動(dòng)物模型常見(jiàn)的有靜脈注射膽紅素溶液、或利用基因缺陷動(dòng)物模型Gunn大鼠建立高膽紅素血癥模型，或利用磺胺類藥物促使腦組織膽紅素濃度升高，故本文對(duì)上述模型進(jìn)行綜述，分析其不同特點(diǎn)，對(duì)研究新生兒高膽紅素血癥提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 腹腔或靜脈注射膽紅素模型

腹腔或靜脈注射膽紅素，是最常見(jiàn)的建模方法，國(guó)內(nèi)學(xué)者采用不同劑量膽紅素(15 mg/kg、30 mg/kg和50 mg/kg）頸靜脈注7 d齡SD大鼠，探討黃疸新生兒免疫功能紊亂易發(fā)生感染的原因，結(jié)果顯示，隨著濃度變化出現(xiàn)不同程度的皮膚黃染，但1 h后均出現(xiàn)皮膚黃染減退［3］。Mesner等［4］同樣以 50 mg/kg濃度靜脈注射小鼠方式建模，并進(jìn)行腦組織病理學(xué)學(xué)分析，結(jié)果顯示：腦干中可見(jiàn)膽紅素結(jié)晶，提示能成功地復(fù)制高膽紅素血癥模型，該種方法干擾因素小，可以達(dá)到理想的膽紅素水平峰值，可應(yīng)用于對(duì)多個(gè)系統(tǒng)的研究。Síma P等［5］給小鼠頸靜脈注入膽紅素后發(fā)現(xiàn)，膽紅素可降低體液免疫反應(yīng)且作用時(shí)間在初次抗體應(yīng)答及產(chǎn)生階段，但靜脈注射的方法膽紅素在體內(nèi)存留時(shí)間過(guò)短，不能模擬高膽紅素持續(xù)損害的過(guò)程，且對(duì)7 d齡大鼠行置管靜脈注射的操作性較差。因此，靜脈注射方法雖然操作難度大，但干擾因素小，可通過(guò)血液循環(huán)分布各個(gè)器官，適用于對(duì)多個(gè)系統(tǒng)的研究，尤其是免疫系統(tǒng)的研究，

陳舜年等［6］采用不同劑量膽紅素腹腔注射新生豚鼠，在給藥后4 h血清膽紅素均達(dá)峰值，并顯示腦組織膽紅素沉積與ATP含量下降；200 μg/g組在給藥后8 h后有明顯神經(jīng)行為變化，并顯示腦組織超微結(jié)構(gòu)改變，表明新生7 d齡豚鼠腹腔給予膽紅素(100～200）μg/g可經(jīng)腹腔收進(jìn)入血液，并通過(guò)血腦屏障沉積于腦組織，致膽紅素腦病發(fā)生；國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)3d齡新生SD大鼠腹腔注射膽紅素，以每天2次連續(xù)注射3 d的方式，建立高膽紅素血癥模型，結(jié)果顯示50 μg/g和100 μg/g濃度，亦可引起膽紅素腦病的發(fā)生［7］。Větvicka等［8］給動(dòng)物腹腔注入膽紅素后，收集腹腔灌洗液在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，滲出的細(xì)胞有大量巨噬細(xì)胞，少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，因此如果進(jìn)行免疫系統(tǒng)研究，化學(xué)性腹膜炎是不可避免的干擾因素。腹腔注射方法相對(duì)靜脈注射操作較為簡(jiǎn)單，建模成功率高，但與靜脈注射方法存在同樣的缺點(diǎn)是：均不能良好的模擬新生兒高膽紅素血癥是紅細(xì)胞破壞增加的致病原因。

2 Gunn大鼠模型

Gunn大鼠為編碼葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的基因缺陷大鼠，類似人類Crigler-Najjar綜合征I，其建模原理是：新生鼠體內(nèi)游離的膽紅素不能轉(zhuǎn)化成結(jié)合型膽紅素被排泄而出現(xiàn)黃疸，因此，Gunn大鼠多被用于開(kāi)展對(duì)遺傳性葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶缺陷和非溶血性高膽紅素血癥的模型研究［9，10］，但是Gunn大鼠的高膽紅膽紅素的濃度往往達(dá)不到核黃疸的程度，國(guó)外有學(xué)者建立 ugt1位點(diǎn)外顯子 4基因突變(ugt-/-）小鼠，該類型小鼠膽紅素濃度可達(dá)到正常鼠的50～60倍，病理結(jié)果可見(jiàn)腦組織黃染［11］。在對(duì)膽紅素的神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，常通過(guò)藥物提高Gunn鼠血中膽紅素濃度，如競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽紅素與白蛋白結(jié)合的磺胺類藥物，破壞紅細(xì)胞膜的鹽酸苯肼等從而建立膽紅素腦病模型，Rice AC［12］采用Gunn大鼠腹腔梯度注射鹽酸苯肼的方法，誘發(fā)溶血來(lái)增加膽紅素水平濃度，并以腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位鑒定核黃疸模型，提示模型的成功，但這類藥物除損傷紅細(xì)胞外，也可致白細(xì)胞減少，損傷動(dòng)物的免疫功能，且該種動(dòng)物模型研究成本較高，基因缺陷是否造成免疫系統(tǒng)缺陷尚不明確。

3 皮下或腹腔注射鹽酸苯肼致溶血模型

鹽酸苯肼經(jīng)腹腔吸收入血后，能迅速與氧合血紅蛋白反應(yīng)，生成高鐵血紅蛋白(MHb）、氮和苯，特異地對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，促進(jìn)血紅蛋白變性；苯肼也可直接破壞紅細(xì)胞膜蛋白和脂類，使紅細(xì)胞膜溶解破裂引起溶血［13］。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)對(duì)7d齡Wistar大鼠皮下注射鹽酸苯肼溶血造成高膽紅素血癥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示皮下注射鹽酸新生大鼠血清總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素較對(duì)照組明顯升高，出現(xiàn)嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙，但對(duì)耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)無(wú)明顯損傷［14］。該種模型的其機(jī)制是利用鹽酸苯肼可破壞動(dòng)物體內(nèi)的紅細(xì)胞，導(dǎo)致溶血，造成膽紅素大量堆積，超過(guò)新生鼠肝臟的代謝能力，未結(jié)合膽紅素水平急劇升高，與新生兒高膽紅素血癥發(fā)病病理生理機(jī)制相似，能良好的模擬新生兒高膽紅素血癥，但鹽酸苯肼作為化學(xué)藥物，除損傷紅細(xì)胞外，也可以損傷免疫細(xì)胞，影響免疫系統(tǒng)，故該種方式不適用于膽紅素對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷研究［15］。

4 延髓注射膽紅素模型

為減少血腦屏障功能的影響，可更直接地研究膽紅素的神經(jīng)毒性，國(guó)內(nèi)學(xué)者采用經(jīng)新生大鼠小腦延髓池注射膽紅素溶液的方法制作膽紅素腦病的動(dòng)物模型，均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為異常，如呼吸不規(guī)則、進(jìn)食少、反應(yīng)差、甚至抽搐，與臨床膽紅素腦病的表現(xiàn)類似。光鏡下可見(jiàn)腦組織膽紅素黃染，海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡和壞死［16］。該方法雖受血腦屏障功能狀態(tài)的影響較小，可更直接地研究膽紅素的神經(jīng)毒性。但是對(duì)新生大鼠小腦延髓池注射本身即對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一種外傷性損害，操作難度較大，易誘發(fā)出血損傷，動(dòng)物建模成功率較低。

5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型選擇

Vannucci等［17］研究表明，7 d齡大鼠和新生兒的腦組織發(fā)育在組織學(xué)方面相似，血腦屏障不完善，與新生兒高膽紅素血容易致膽紅素腦病的病變特點(diǎn)相吻合，故文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)研究多采用7 d齡SD或者wistar大鼠，亦有報(bào)道國(guó)內(nèi)學(xué)者選取3 d齡和9 d齡大鼠［7，18］。動(dòng)物類型選擇上除選用SD或者wistar大鼠外，豚鼠及新西蘭仔兔也多有報(bào)道［19，20］。目前新生兒高膽紅素血癥的研究多集中在膽紅素所致神經(jīng)毒性方面，如神經(jīng)細(xì)胞能量代謝的改變，遞質(zhì)的攝取與釋放，突觸受體功能和興奮性氨基酸調(diào)控等，動(dòng)物模型建立多為腹腔或靜脈直接注射膽紅素方式，動(dòng)物類型的選擇上多根據(jù)研究的內(nèi)容方向來(lái)確定。

綜上所述，確立研究方向后，應(yīng)根據(jù)所研究?jī)?nèi)容，選擇與所研究系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制、代謝特點(diǎn)相似，干擾因素相對(duì)較小的新生兒高膽紅素血癥動(dòng)物模型。

［1］Watchko JF，Tiribelli C.Bilirubin-induced neurologic damagemechanisms and management aPProaches［J］.N Engl J Med，2013，369(21）：2021-2030.

［2］Bhutani VK，Wong RJ. Bilirubin neurotoxicity in Preterm infants：risk and Prevention［J］.J Clin Neonatol，2013，2(2）：61-69.

［3］梁小明，陳昌輝，邵天偉，等.靜脈注入膽紅素對(duì)新生大鼠脾磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華實(shí)用兒科臨床雜志，2014，29(12）：931 -935.

［4］Mesner O，Miller MJ，Iben SC，et al.HyPerbilirubinemia diminishes resPiratory drive in a rat PuP model［J］.Pediatr Res，2008，64(3）：270-274.

［5］Síma P，Malá J，Miler I，et al.The suPPressive effect of continuous infusion of bilirubin on the immune resPonse in mice［J］.Folia Microbiol(Praha），1980，25(6）：483-490.

［6］陳舜年，賁小明，李佩紅，等.膽紅素腦病動(dòng)物模型的制作與鑒定［J］.新生兒科雜志，1997，12(4）：166-168.

［7］王曉麗，郭明星，梁俊暉，等.新生大鼠高膽紅素血癥及腦病模型的建立與評(píng)價(jià) ［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30( 8）：1523-1531.

［8］V tvicka V1，Rossmann P，Bilej M，et al.In vivo interaction of bilirubin with the cells of the immune system in mice：an ultrastructural electronmicroscoPic study［J］.Cell Biol Int ReP，1989，13(3）：301-308.

［9］Schreuder AB，Vanikova J，Vitek L，et al.OPtimizing exchange transfusion for severe unconjugated hyPerbilirubinemia：studies in the Gunn rat［J］.PLoS ONE，2013，8(10）：e77179.

［10］Shaia WT1，ShaPiro SM，SPencer RF.The jaundiced Gunn rat model of auditory neuroPathy/dyssynchrony［J］.LaryngoscoPe，2005，115(12）：2167-73.

［11］Nguyen N，Bonzo JA，Chen S，et al.DisruPtion of the ugt1 locus in mice resembles human Crigler-Najjar tyPe I disease［J］.J Biol Chem，2008，283(12）：7901-7911.

［12］Rice AC1，ShaPiro SM.A new animal model of hemolytic hyPerbilirubinemia-induced bilirubin encePhaloPathy (kernicterus）［J］.Pediatr Res，2008，64(3）：265-269.

［13］周光興，高誠(chéng)，徐平，等.人類疾病動(dòng)物模型復(fù)制方法學(xué)［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社.2007：233-234.

［14］陳培培，郭維維，楊仕明，等.高膽紅素血癥動(dòng)物模型的建立及對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷評(píng)估［J］.中華耳科學(xué)雜志，2012，10 (1）：101-104.

［15］黃波，李靜，王小中，等.溶血性貧血大鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(5）：703-705.

［16］胡影，田巧紅，華子瑜，等.小腦延髓池注射膽紅素溶液建立新生大鼠膽紅素腦病模型的評(píng)價(jià) ［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35(2）：177-181，244.

［17］Vannucci RC，Connor JR，Mauger DT，et al.Rat model of Perinatal hyPoxic-ischemic brain damage［J］.J Neurosci Res，1999，55(2）：158-163.

［18］程小杰.新生大鼠膽紅素腦病神經(jīng)遞質(zhì)變化的HR1HMRS和病理學(xué)研究［D］.溫州醫(yī)學(xué)院，2013，13-14.

［19］何平，李雪琴，王廷華，等.新生豚鼠膽紅素腦病時(shí)皮層及海馬BDNF及其mRNA表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，21(1）：27-32.

［20］王麗梅，郝艷秋，石麗宏.局部亞低溫對(duì)膽紅素腦病仔兔腦基底節(jié)中多巴胺及5-羥色胺的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2010，16(1）：35-37.

Research advances in animal models of neonatal hyperbilirubinemia

YANG Li，WU De，TANG Jiu-lai
(The First Affiliated HosPital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

There are many ways to establish animal models of neonatal hyPerbilirubinemia，such as intraPeritoneal or intravenous injection，genetic defect animal models，the use of chemical drugs，and injection of bilirubin into cerebellomedullary cistern，and so on.In order to study the etiology，Pathogenesis，and theraPy of neonatal hyPerbilirubinemia through animal models，we review the literature on rodent and Primate models of neonatal hyPerbilirubinemia，including establishment of models and their aPPlications，in order to Provide reference for the research of neonatal hyPerbilirubinemia.

Neonatal hyPerbilirubinemia；Models，animal

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

A

1671-7856（2015）09-0078-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.015

國(guó)家自然科學(xué)基項(xiàng)目(編號(hào)：81270665），科技部項(xiàng)目(編號(hào)：2014BAL03B00）。

楊李(1982-），男，在讀博士，專業(yè)：小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床。E-mail：younglee168@126.com。

唐久來(lái)(1953-），男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)：小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床。E-mail：tangjiulai8888@163.com。

2015-08-08

管理科學(xué)