過表達(dá)D5 Stat5a促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖及IGFBP-7基因啟動(dòng)子組蛋白甲基化

聶璽 張潔 余超 譚敦勇

吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與免疫學(xué)系，湖南吉首416000

過表達(dá)D5 Stat5a促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖及IGFBP-7基因啟動(dòng)子組蛋白甲基化

聶璽 張潔 余超 譚敦勇

吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與免疫學(xué)系，湖南吉首416000

目的探討D5 Stat5a對人類前列腺癌細(xì)胞增殖的影響及其對胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP-7）表達(dá)的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞（DU145及PC3），并隨機(jī)分為四組：對照組及三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對照組以不含外源基因的腺病毒感染，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則以攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染，其病毒感染增殖活性（MOI）依次為10、20及30。四組細(xì)胞均在培養(yǎng)液中加入催乳素（50 ng/mL）以啟動(dòng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。運(yùn)用MTS方法檢測細(xì)胞增殖；實(shí)時(shí)定量PCR檢測抑癌基因IGFBP-7及EZH2 mRNA水平；染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）檢測IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白甲基化程度；蛋白質(zhì)印跡法檢測IGFBP-7蛋白表達(dá)。結(jié)果攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染能夠呈劑量依賴式地促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞（DU145及PC3）增殖。如PC3細(xì)胞，對照組細(xì)胞的相對活細(xì)胞數(shù)為（1.362±0.018），三個(gè)實(shí)驗(yàn)組相對活細(xì)胞數(shù)分別為（1.453±0.022）（P＞0.05）、（1.649±0.020）（P＜0.05）及（1.829± 0.027）（P＜0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白印跡證明D5 Stat5a過表達(dá)明顯下調(diào)IGFBP-7的表達(dá)。DU145及PC3對照組細(xì)胞IGFBP-7 mRNA相對值分別為（0.796±0.023）及（0.871±0.046），而感染攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒（MOI 30）后，其IGFBP-7 mRNA相對值則分別下降到（0.148±0.019）（P＜0.01）及（0.078±0.021）（P＜0.01）。染色質(zhì)免疫共沉淀分析（ChIP-Assay）證實(shí)，D5 Stat5a導(dǎo)致IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白甲基化（H3K27Me3）水平顯著上升。DU145細(xì)胞對照組與實(shí)驗(yàn)組，其沉淀DNA比例分別為（0.0176±0.0030）%及（0.0650±0.0099）%，兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。此外，實(shí)時(shí)定量PCR檢測表明，D5 Stat5a引起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2 mRNA大幅上升。DU145細(xì)胞對照組及D5 Stat5a感染組相對mRNA水平分別為（0.0033±0.0004）及（0.0160±0.0035），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子D5 Stat5a能夠顯著促進(jìn)人類前列腺癌細(xì)胞的增殖，其主要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制在于D5 Stat5a增加EZH2基因表達(dá)，導(dǎo)致抑癌基因IGFBP-7啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白甲基化，使啟動(dòng)子活性降低，IGFBP-7表達(dá)下降，是導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的異常增殖分子機(jī)制之一。

D5 Stat5a；前列腺癌細(xì)胞；表觀遺傳學(xué)；組蛋白甲基化；染色質(zhì)免疫共沉淀

轉(zhuǎn)錄因子Stat5（signal transduction and activation of transcription 5）是催乳素、生長因子以及一系列細(xì)胞因子信號通路的重要環(huán)節(jié)［1-2］，在乳腺以及前列腺的發(fā)育、分化［3-4］等生理活動(dòng)中起著極為重要的作用。Stat5基因表達(dá)異常會導(dǎo)致乳腺以及前列腺發(fā)育以及生殖功能障礙等一系列病理過程的出現(xiàn)［5］。Stat5包括Stat5a及Stat5b兩種，兩者高度同源，且作用相近，由兩個(gè)獨(dú)立基因編碼［6］。有人推測，Stat5a及Stat5b基因由同一個(gè)組基因復(fù)制而來［6］。有證據(jù)表明，Stat5的異常表達(dá)可能參與了某些生殖腫瘤尤其是乳腺癌及前列腺癌等的病理過程［7］。但有關(guān)Stat5在腫瘤如乳腺癌及前列腺癌形成、發(fā)展及預(yù)后中的確切作用，目前尚無定論，且有關(guān)此方面的報(bào)道，多相互矛盾。Sultan等［8］曾檢測人類乳腺癌組織中Stat5a的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Stat5a的表達(dá)量與患者的預(yù)后有密切關(guān)系，Stat5a表達(dá)量越高預(yù)后越好。而更多的研究則表明，Stat5作為一種病理因素參與了前列腺癌及乳腺癌的發(fā)病過程［9］。

D5 Stat5a是最近自人前列腺腺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞所克隆的Stat5a的一種變體［10-11］，因其N-端30個(gè)氨基酸丟失且對應(yīng)于此30個(gè)氨基酸的基因DNA恰好為Stat5a基因的第5個(gè)外顯子（90個(gè)堿基對），因而將此變體命名為Delta 5 Stat5a或簡稱D5 Stat5a。筆者以前的工作已經(jīng)證明，該變體在生物學(xué)特性上與全長的Stat5a有共同點(diǎn)，例如作為轉(zhuǎn)錄因子，依然能夠響應(yīng)相應(yīng)的配體如催乳素所啟動(dòng)的細(xì)胞信號，進(jìn)而二聚化并完成核轉(zhuǎn)位，最后與相應(yīng)的DNA位點(diǎn)結(jié)合。但除此之外，此變體在生物學(xué)功能上卻有著極為重要的區(qū)別，主要表現(xiàn)D5 Stat5a能夠與不同的其他轉(zhuǎn)錄因子交互作用，并顯著促進(jìn)某些癌細(xì)胞如乳腺癌及前列腺癌細(xì)胞的增殖及去分化。D5 Stat5a在人類乳腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞有異常表達(dá)［10］，意味著D5 Stat5a可能是前列腺癌、乳腺癌得以形成的一種重要的病理因素。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7（insulin-likegrowth factor 7，IGFBP-7）與胰島素樣生長因子受體具有很強(qiáng)的結(jié)合活性，能夠阻擋胰島素樣生長因子（IGF）與其受體的結(jié)合，因而IGFBP-7能夠抑制胰島素樣生長因子的活性［12］，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等過程［13］。有報(bào)道表明，IGFBP-7對腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用［13-14］。本研究除了檢測及確認(rèn)D5 Stat5a對培養(yǎng)狀態(tài)的人類前列腺癌細(xì)胞DU145及PC3增殖的影響外，利用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白印跡（Western blot）及染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）分析等方法，分析高表達(dá)D5 Stat5a對胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP-7）基因表達(dá)的影響以及其啟動(dòng)子區(qū)域表觀遺傳學(xué)修飾的改變（組蛋白甲基化），以期闡明D5 Stat5a與前列腺癌的病理聯(lián)系及其可能的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人類前列腺癌細(xì)胞DU145、PC3（中南大學(xué)細(xì)胞庫）、RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）、抗H3K27Me3抗體（美國Millimore公司）、抗IGFBP-7抗體（美國Santa Cruz生物公司）、細(xì)菌蛋白G磁珠（美國Invitro gen公司）、細(xì)胞增殖分析試劑MTS［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium］以及蛋白印跡顯影試劑ECL（Enhanced chemiluminescent substrate）（美國Promega公司）。

1.2 攜帶D5 Stat5a cDNA腺病毒制作

為提高基因轉(zhuǎn)移效率，本研究采用腺病毒基因轉(zhuǎn)移法，其制作方法依據(jù)Stratagene公司建議的制作程序。基本步驟：①將D5 Stat5a cDNA克隆至穿梭載體（pShuttle-IRES-hrGFP-1）；②利用同源重組原理將穿梭載體的D5 Stat5a cDNA上傳到腺病毒基因組（Ad5），該病毒基因組經(jīng)人工改造去掉其與病毒復(fù)制有關(guān)的E1及E2序列；③確認(rèn)重組成功后，將其轉(zhuǎn)入經(jīng)特殊處理的細(xì)菌株（XL10-GoldR）大量擴(kuò)增（重組體在該細(xì)菌內(nèi)只能擴(kuò)增但不能再發(fā)生新的重組以保證重組的準(zhǔn)確及穩(wěn)定）；④提取重組體，以限制性內(nèi)切酶PacⅠ進(jìn)行酶切處理以暴露其末端反向重復(fù)序列（invert terminal repeat，ITR），然后將其轉(zhuǎn)入AD-293細(xì)胞，使其包裝成有活性的病毒；⑤病毒活性（滴度）以病毒感染AD-293細(xì)胞后形成病毒斑塊的能力（plaque forming unit，PFU）表示，而PFU總數(shù)與待感染的細(xì)胞總數(shù)之比值即為病毒感染增殖活性（multiplicity of infection，MOI）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移及活細(xì)胞計(jì)數(shù)（MTS法）

人類前列腺癌細(xì)胞（DU145、PC3）用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的貼壁密度或貼壁面積為70%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h（細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)）以使所有細(xì)胞均處于G0期后，換為正常培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞貼壁密度達(dá)到70%后，細(xì)胞（DU145及PC3）隨機(jī)分為四組：對照組及三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對照組以不含外源基因的腺病毒感染，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則以攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染，其病毒MOI依次為10、20及30。病毒感染120 min后，換為正常培養(yǎng)液，四組細(xì)胞均在培養(yǎng)液中加入催乳素（50 ng/mL）以啟動(dòng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)時(shí)四組之外另設(shè)一組對照細(xì)胞，不加催乳素）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTS試劑并測定其波長為492 nm的吸光值，得到相對活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 染色質(zhì)免疫共沉淀分析（ChIP Assay）

人類前列腺癌細(xì)胞（DU145、PC3）經(jīng)病毒感染處理后，吸棄培養(yǎng)液，并以冰冷的PBS（phosphate buffer solution）緩沖液洗3次，繼之：①以新鮮配制的1%甲醛固定，10 min后，以甘氨酸終止甲醛活性；②吸棄甲醛固定液，以細(xì)胞收集液（100 mmol/L Tris-Cl，pH 9.4，10 mmol/L DTT）收集細(xì)胞，冰冷PBS緩沖液洗細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液（1%SDS，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，50 mmol/L Tris-Cl，pH 8.1，1×蛋白酶抑制劑），并以超聲粉碎儀破碎基因組DNA至500 bp左右片段；③以ChIP稀釋液（1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.1，1×蛋白酶抑制劑）1∶10稀釋；④加入抗H3K27Me3抗體，4℃輕搖過夜（與此同時(shí)，另設(shè)一平行管，加入IgG以得到非特異性結(jié)合的數(shù)據(jù)）；⑤以含細(xì)菌蛋白G的磁珠沉淀；⑥以洗脫液（1%SDS，TE緩沖液配制）將DNA-H3K27Me3-抗體復(fù)合物自磁珠上洗脫；⑦65℃過夜以解除固定，繼之用蛋白酶H消化蛋白（抗體）；⑧純化DNA；⑨實(shí)時(shí)定量PCR檢測、確認(rèn)被抗H3K27Me3抗體沉淀的DNA中是否含有IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA序列及含量。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitativerealtimepolymerasechain reaction，qRT-PCR）

本研究中使用實(shí)時(shí)定量PCR有兩個(gè)目的，一是染色質(zhì)免疫共沉淀后，需要確認(rèn)被沉淀的DNA序列；二是檢測IGFBP-7基因的表達(dá)狀況。其操作步驟依照公司說明書進(jìn)行：①引物設(shè)計(jì)，本研究的PCR引物包括用于檢測染色質(zhì)免疫共沉淀后DNA的引物（對應(yīng)于IGFBP-7基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行設(shè)計(jì)）以及用于檢測IGFBP-7及EZH2 mRNA的引物，見表1；②底物為SYNR Green；③PCR參數(shù)，變性95°C 1 min，退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s，收集40個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并得到相應(yīng)的Ct值；④ChIP DNA的相對量以未經(jīng)免疫沉淀時(shí)DNA中所含IGFBP-7基因DNA量（Input）為參照，計(jì)算其被沉淀的IGFBP-7啟動(dòng)子序列DNA占Input的百分?jǐn)?shù)。IGFBP-7 mRNA的相對量則以管家基因18 SrRNA為對照計(jì)算。具體計(jì)算方法如下：相對mRNA量=（每個(gè)樣本的18S rRNA的Ct值-每個(gè)樣本的IGFBP-7的Ct值）2。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法

人前列腺癌細(xì)胞（PC3）經(jīng)攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染后，吸棄培養(yǎng)液，并經(jīng)冰冷PBS洗3次，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液（RIPA），12 000 r/min離心，收集上清，測定蛋白濃度，然后進(jìn)行下述步驟：①電泳分離：樣本加入上樣液并經(jīng)煮沸5 min變性，每孔上樣20 μg，100V電泳90 min；②轉(zhuǎn)膜：應(yīng)用半干轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad）7 V轉(zhuǎn)膜45 min；③抗原抗體反應(yīng)：上述經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜，經(jīng)PBST（phosphate buffered saline tween 20）洗3次（每次10 min）并經(jīng)非特異位點(diǎn)封閉后，加入抗IGFBP-7抗體，4℃過夜，第2天進(jìn)行二抗反應(yīng)；④顯影：運(yùn)用ECL試劑并經(jīng)X光片記錄發(fā)光強(qiáng)度及位置。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，本實(shí)驗(yàn)所測得數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布者被視為有效數(shù)據(jù)，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D5 Stat5a對人類前列腺癌細(xì)胞增殖的影響

對照組細(xì)胞，分別給予或不給予催乳素（50 ng/mL）處理，結(jié)果顯示給予催乳素處理后，相較于沒有給予催乳素處理的細(xì)胞，其細(xì)胞增殖略顯增加，但兩者之間的活細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，則由于感染不同劑量（MOI 10、20及30）的腺病毒（攜帶D5 Stat5a cDNA），在加入催乳素的情況下，其活細(xì)胞計(jì)數(shù)呈劑量依賴式增加。DU145及PC3細(xì)胞，D5 Stat5a均有促進(jìn)其增殖的作用。PC3細(xì)胞對照組（加入催乳素）相對活細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1.362± 0.018），當(dāng)MOI分別為10、20及30時(shí)，其活細(xì)胞相對計(jì)數(shù)分別為（1.453±0.022）（P＞0.05）、（1.649±0.020）（P＜0.05）及（1.829±0.027）（P＜0.05）；DU145細(xì)胞，對照組相對活細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1.339±0.0233），當(dāng)MOI分別為10、20及30時(shí)，其活細(xì)胞相對計(jì)數(shù)分別為（1.391±0.018）（P＞0.05），（1.629±0.030）（P＜0.05）及（1.755±0.026）（P＜0.01）。見圖1。

2.2 D5 Stat5a過表達(dá)對IGFBP-7基因表達(dá)的影響

運(yùn)用qRT-PCR及Western blot方法檢測了DU145及PC3細(xì)胞的IGFBP-7 mRNA水平以及PC3細(xì)胞的IGFBP-7蛋白水平。結(jié)果如圖2A所示，DU145及PC3細(xì)胞在轉(zhuǎn)入含有D5 Stat5a cDNA的腺病毒后，IGFBP-7 mRNA下降明顯，當(dāng)細(xì)胞分別感染攜帶D5 Stat5a cDNA病毒MOI 10、20及30后，DU145細(xì)胞IGFBP-7 mRNA相對值由對照細(xì)胞的（0.796±0.023）減少至（0.752±0.068）（P＞0.05）、（0.534±0.007）（P＜0.05）及（0.148±0.019）（P＜0.01）；PC3細(xì)胞IGFBP-7 mRNA相對值由對照細(xì)胞的（0.871±0.046）減少至（0.690±0.047）（P＞0.05）、（0.472±0.075）（P＜0.01）及（0.078±0.021）（P＜0.01）。與之相應(yīng)，PC3細(xì)胞中IGFBP-7蛋白水平，在D5 Stat5a作用下亦出現(xiàn)下降（圖2B），對照細(xì)胞IGFBP-7蛋白相對值為（1151.387±55.909），當(dāng)感染病毒MOI 10、20及30時(shí)，其IGFBP-7蛋白相對值分別為（1035.863± 36.028）（P＞0.05）、（798.233±71.806）（P＞0.05）及（283.577±35.715）（P＜0.01）。

2.3 D5 Stat5a對前列腺癌細(xì)胞IGFBP-7基因啟動(dòng)子組蛋白甲基化的影響

如結(jié)果“2.1”所示，過量表達(dá)Stat5a能夠顯著促進(jìn)培養(yǎng)狀態(tài)的前列腺癌細(xì)胞的增殖。IGFBP-7是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，有報(bào)道表明，前列腺癌組織IGFBP-7表達(dá)往往出現(xiàn)異常（降低）。筆者推測，D5 Stat5a促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖可能與改變IGFBP-7基因的表達(dá)有關(guān)。本研究a在探討D5 Stat5a能否改變IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域的表觀遺傳學(xué)。本研究檢測了組蛋白3的第27位賴氨酸的甲基化程度（H3K27Me3），前列腺癌細(xì)胞（DU145及PC3）經(jīng)不含（Con）或含有D5 Stat5a cDNA的腺病毒（D5）轉(zhuǎn)染后，沿染色質(zhì)免疫共沉淀途徑固定細(xì)胞、超聲得到500 bp左右染色質(zhì)DNA片段，以抗H3K27Me3抗體沉淀后，得到相應(yīng)DNA片段，最終以實(shí)時(shí)定量PCR探測IGFBP-7啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段。結(jié)果表明，過量表達(dá)D5 Stat5a的細(xì)胞，其染色質(zhì)沉淀中含有大量被抗H3K27Me3沉淀的DNA片段。如圖3所示，DU145細(xì)胞對照組與實(shí)驗(yàn)組，其沉淀DNA比例分別為（0.0176± 0.0030）%及（0.0650±0.0099）%，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；PC3細(xì)胞對照組與實(shí)驗(yàn)組，其沉淀DNA比例分別為（0.0142±0.0009）%及（0.0480± 0.0036）%，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；說明D5 Stat5a能夠?qū)е翴GFBP-7啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27的三甲基化。實(shí)驗(yàn)中，本研究還使用了非特異性IgG抗體進(jìn)行沉淀，結(jié)果表明，所有組別的DNA沉淀比例均低于0.005%，表明染色質(zhì)免疫共沉淀是特異的。此外，為消除引物對基因組DNA的非特異性結(jié)合的影響，還運(yùn)用了非特異性無關(guān)引物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，無關(guān)引物并沒有探測到明顯的被沉淀的DNA片段，所有組別的DNA沉淀比例均低于0.005%（P＜0.01），說明染色質(zhì)沉淀是基因特異的。

2.4 D5 Stat5a過表達(dá)上調(diào)EZH2基因表達(dá)

EZH2（Enhancer of Zesste Homology 2）是一種組蛋白賴氨酸N甲基轉(zhuǎn)移酶，主要作用于核小體組蛋白3的27位賴氨酸殘基（H3K27），導(dǎo)致3個(gè)甲基集團(tuán)轉(zhuǎn)移至H3K27（H3K27Me3），因而EZH2是導(dǎo)致H3K27Me3形成的關(guān)鍵因素。在結(jié)果“2.3”所示實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測了前列腺癌細(xì)胞過表達(dá)D5 Stat5a之后對EZH2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，D5 Stat5a能夠顯著上調(diào)EZH2 mRNA水平，DU145細(xì)胞對照組及D5 Stat5a感染組（MOI 30）其相對mRNA水平分別為（0.0033± 0.0004）及（0.0160±0.0035），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PC3細(xì)胞分別為（0.0038±0.0014）及（0.0200±0.0021），兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。提示D5 Stat5a首先通過提升EZH2基因表達(dá)水平，繼而導(dǎo)致IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的甲基化。

3 討論

關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子Stat5a在生殖系統(tǒng)腫瘤形成中的作用，是近十年來研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)之一［15］，有關(guān)Stat5在乳腺癌及前列腺癌的形成、發(fā)展及預(yù)后方面的真正作用，目前尚無定論。盡管已經(jīng)有不少報(bào)道，將Stat5的表達(dá)與生殖系統(tǒng)癌癥聯(lián)系起來，但從報(bào)道的結(jié)果看，往往相互矛盾。Sultan等［8］報(bào)道表明，Stat5a的含量越高癌癥患者（例如乳腺癌）的預(yù)后越好，說明Stat5a是一種抑癌因素。也有報(bào)道表明，Stat5a作為一種病理因素參與了腫瘤（如乳腺癌）的形成和發(fā)展［9］。D5 Stat5a的發(fā)現(xiàn)為解決這一矛盾提供了新的思路，筆者以前的工作已經(jīng)證明，作為轉(zhuǎn)錄因子，D5 Stat5a與全長的Stat5a一樣，能夠在相應(yīng)細(xì)胞信號的作用下，完成二聚化及核轉(zhuǎn)移，并與相應(yīng)的靶基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，但D5 Stat5a其N'-端30個(gè)氨基酸的丟失又導(dǎo)致了D5 Stat5a與全長的Stat5a具有不同的功能［10-11］。主要表現(xiàn)在D5 Stat5a對人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7及T47D）以及前列腺癌細(xì)胞（DU145）的增殖有較強(qiáng)的刺激作用，而全長的Stat5a無此作用。同時(shí)，由于全長的Stat5a及D5 Stat5a兩者只相差30個(gè)氨基酸，兩者的分子量相差很?。ㄒ粸?4 kD，一為92 kD），一般的Western blot很難將其分離，這也就是為什么D5 Stat5a沒有被更早發(fā)現(xiàn)的原因之一。因而前述筆者報(bào)道的有關(guān)Stat5a的作用可能實(shí)際上包含Stat5a及D5 Stat5a兩種分子的作用，這也部分解釋了出現(xiàn)矛盾結(jié)果的原因。

本研究采用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法使前列腺癌細(xì)胞得以過量表達(dá)Stat5a。根據(jù)以前的經(jīng)驗(yàn)，在基因轉(zhuǎn)染過程中，若采用化學(xué)轉(zhuǎn)移法（如使用lipofectamine等試劑轉(zhuǎn)染），人類乳腺癌細(xì)胞（T47D、MCF-7）及前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率較低（低于50%），因而影響試驗(yàn)結(jié)果。本研究采用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法，理論上，轉(zhuǎn)移效率可以達(dá)到90%以上。本研究首先檢測了過量表達(dá)D5 Stat5a后對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，過量表達(dá)D5 Stat5a之后，DU145及PC3的細(xì)胞密度，顯著上升，且呈劑量依賴關(guān)系。此外，由于催乳素是Stat5a及D5 Stat5a的有效激活劑，本研究設(shè)置了兩組對照，兩組對照均以不攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒（空病毒）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中一組細(xì)胞不加入催乳素，而另一組對照則加入催乳素以激活D5 Stat5a。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入催乳素的對照組，雖然沒有過量表達(dá)外源D5 Stat5a，但細(xì)胞密度亦有少量增加，應(yīng)為催乳素刺激激活內(nèi)源性D5 Stat5a所致（腫瘤細(xì)胞在自然狀態(tài)下亦可生成D5 Stat5a）。根據(jù)本研究結(jié)果認(rèn)為，至少在細(xì)胞增殖方面，D5 Stat5a所起作用為病理性的。

IGFBP-7能夠有效影響IGF與其相應(yīng)受體的結(jié)合，是調(diào)控細(xì)胞增殖的因素之一［16］，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)系［11］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，IGFBP-7屬于抑癌因素，其基因?qū)儆谝职┗颍?7］。為闡明D5 Stat5a的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用是否與IGFBP-7有關(guān)，本研究運(yùn)用qRT-PCR及Western blot法對過表達(dá)D5 Stat5a的前列腺癌細(xì)胞IGFBP-7 mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果如預(yù)期，過量表達(dá)D5 Stat5a能夠顯著下調(diào)IGFBP-7的mRNA及蛋白水平。這一結(jié)果提示D5 Stat5a促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞（筆者以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）的增殖，其途徑之一是抑制抑癌基因IGFBP-7的表達(dá)。

為探討D5 Stat5a如何抑制IGFBP-7基因的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀法，對過量表達(dá)D5 Stat5a后的前列腺癌細(xì)胞IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域的表觀遺傳學(xué)修飾進(jìn)行了檢測。在攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒轉(zhuǎn)染，并經(jīng)1%甲醛固定后，DU145及PC3染色質(zhì)DNA經(jīng)超聲粉碎至500 bp左右的片段，以抗H3K27Me3抗體對DNA片段進(jìn)行沉淀。結(jié)果表明，IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA被大量沉淀，說明過量表達(dá)D5 Stat5a能夠促進(jìn)IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27Me3修飾。H3K27Me3對基因組DNA與組蛋白的相互作用具有非常直接的影響。大量研究表明，這一修飾能夠嚴(yán)重干擾與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)因子進(jìn)入基因啟動(dòng)子區(qū)域，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［18］。由此，筆者確認(rèn)上述D5 Stat5a抑制IGFBP-7表達(dá)，是由于D5 Stat5a導(dǎo)致了IGFBP-7基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27Me3，從而封閉IGFBP-7基因啟動(dòng)子所致。此外，如結(jié)果圖3所示，在對照組DU145及PC3細(xì)胞，與使用抗IgG的非特異性抗體相比，使用抗H3K27Me3抗體，沉淀后其所含IGFBP-7基因啟動(dòng)子片斷較多，推測導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因，可能是前列腺癌細(xì)胞實(shí)際上在D5 Stat5a作用前，已經(jīng)存在IGFBP-7基因啟動(dòng)子H3K27Me3現(xiàn)象。

由于H3K27Me3主要由另一種甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2介導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)還檢測了D5 Stat5a對前列腺癌細(xì)胞EZH2表達(dá)（mRNA）的影響。如結(jié)果圖4所示，雖然在無外源D5 Stat5a轉(zhuǎn)入（對照）的情況下，EZH2亦有一定的表達(dá)（這符合EZH2通常在癌細(xì)胞表達(dá)的現(xiàn)象），但D5 Stat5a的過表達(dá)能夠顯著上調(diào)EZH2表達(dá)水平，是對照細(xì)胞EZH2 mRNA水平的2倍以上。

綜上所述，D5 Stat5a確有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞（DU145、PC3）增殖的作用，其分子機(jī)制之一是通過刺激EZH2的表達(dá)，改變IGFBP-7啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白表觀遺傳學(xué)修飾，促進(jìn)H3K27Me3，從而抑制IGFBP-7基因的表達(dá)。結(jié)合以前的工作，筆者推測，D5 Stat5a的高表達(dá)可能是促進(jìn)前列腺癌形成的因素之一。有關(guān)D5 Stat5a的作用機(jī)制，依然存在大量工作需要完成，許多問題有待進(jìn)一步回答，例如導(dǎo)致EZH2基因表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制如何？D5 Stat5a可否作為未來治療生殖系統(tǒng)腫瘤的靶點(diǎn)？這些都有待進(jìn)一步深入探討。

［1］譚敦勇，彭湘萍.催乳素受體研究［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2012，43（1）：17-23.

［2］Tan DY，Johnson DA，Wu W，et al.Unmodified Prolactin（PRL）and S179D PRL-initiated Bioluminescence Resonance Energy Transfer between Homo-and Hetero-pairs of Long and Short Human Prolactin Receptors in Living Human Cells［J］.Mol Endocrinol，2005，19（5）：1291-1303.

［3］Reichenstein M，Rauner G，Barash I.Conditional repression of STAT5 expression during lactation reveals its exclusive roles in mammary gland morphology，milk-protein gene expression，and neonate growth［J］.Mol Reprod Dev，2011，78（8）：585-96.

［4］Tan SH，Dagvadorj A，Shen F，et al.Transcription Factor Stat5 Synergizes with Androgen Receptor in Prostate Cancer Cells［J］.Cancer Research，2008，88（1）：236-248.

［5］Yu H，Pardoll P，Jove R.STATs in cancer inflammation and immunity：aleading role for STAT3［J］.Nature Reviews Cancer，2009，9：798-809.

［6］Grimley PM，Dong F，Rui H.Stat5a and Stat5b：fraternal twins of signal transduction and transcriptional activation［J］. Cytokine&Growth Factor Reviews，1999，10：131-157.

［7］Koptyra M，Gupta S，Talati P，et al.Signal transducer and activator of transcription 5a/b：biomarker and therapeutic target in prostate and breast cancer［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（10）：1417-1421.

［8］SultanAS，XieJ，LeBaronMJ，etal.TranscriptionFactorStat5 Stimulates Homotypic Adhesion and Inhibits Invasive Characteristics of Human Breast Cancer Cells［J］.Oncogene，2005，24（5）：746-760.

［9］Lei G，Vogiatzi P，Puhr M，et al.Stat5 promotes metastatic behavior of human prostate cancer cells in vitro and in vivo［J］.Endocrine-Related Cancer，2010，17：481-493.

［10］Tan DY，Chen KHE，Deng CH，et al.An N-terminal splice variant of human Stat5a that interacts with different transcription factors is the dominant form expressed in invasive ductal carcinoma［J］.Cancer Letters，2014，346（1）：148-157.

［11］Tan DY，Zhang J，Tang PZ，et al.Association of D5 Stat5a Induc ed Breast Cancer Cell Migration with Increased H3K27 Trimethylation and Down-Regulated Expression of E-Cadherin Gene［J］.Adaptive Medicine，2013，5（4）：189-195.

［12］Wajapeyee N，Serra RW，Zhu X，et al.Oncogenic BRAF induces senescence and apoptosis through pathways mediated by the secreted protein IGFBP7［J］.Cell，2008，132：363-374.

［13］Suzuki H，Igarashi S，Nojima M，et al.IGFBP7 is a p53-responsive gene specifically silenced in colorectal cancer with CpG island methylator phenotype［J］.Carcinogenesis，2010，31：342-349.

［14］Sullivan L，Murphy TM，Barrett C，et al.IGFBP7 promoter methylation and gene expression analysis in prostate cancer［J］.J Urol，2012，188（4）：1354-1360.

［15］Liao ZY，Levaneinen MT.Targeting transcription factor stat5a/b as a therapeutic strategy for prostate cancer［J］. Am J Transl Res，2011，3（2）：133-138.

［16］Jiang W，Xiang C，Cazacu S，et al.Insulin-like growth factor binding protein 7 mediates glioma cell growth and migration［J］.Neoplasia，2008，10（12）：1335-1342.

［17］Chen D，Siddiq A，Emdad L，et al.Insulin-like growth factor-binding protein-7（IGFBP7）：a promising gene therapeutic for hepatocellular carcinoma（HCC）［J］.Mol Ther，2013，4：758-766.

［18］Sullivan L，Murphy TM，Barrett C，et al.IGFBP7 promoter methylation and gene expression analysis in prostate cancer［J］.J Urol，2012，188（4）：1354-1360.

Over-expression of D5 Stat5a induces proliferation of human prostate cancer cells and histone trimethylation of IGFBP-7 promoter region

NIE XiZHANG JieYU ChaoTAN Dunyong
Department of Biochemistry&Immunology,Jishou University College of Medicine,Hu'nan Province,Jishou416000, China

ObjectiveTo clarify the effect of D5 Stat5a on the proliferation of prostate cancer cells and the expression of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP-7).MethodsProstate cancer cells(DU145 and PC3)were randomly divided into four groups:control and three experimental groups.The cells were infected with adenovirus carrying or not carrying(Con)D5 Stat5a cDNA at MOI 10,20 and 30 respectively for 120 min and cultured in the presence of prolactin(50 ng/mL)for further 48 h.The relative viable cell number was determined by MTS assay.Quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR)and Western blot were used to examine the expression of IGFBP-7. Chromatin immunoprecipitation(ChIP)assay was also applied to examine the effect of D5 Stat5a on the trimethylation of histone 3 of IGFBP-7 gene promoter region.ResultsAdenovirus(carrying D5 Stat5a)infection induced proliferation of prostate cancer cells in a dose-dependant manner.Taking PC3 as example,therelative viable cell number was(1.362±0.018)in control cells,while infection with adenovirus carrying D5 Stat5a cDNA at MOI 10,20 or 30 increased the relative vialble cell number to(1.453±0.022)(P＞0.05),(1.649±0.020)(P＜0.05) and(1.829±0.027)(P＜0.05),respectively.qRT-PCR showed that the relative IGFBP-7 mRNA amounts were(0.796± 0.023)and(0.871±0.046)in DU145 and PC3 control cells respectively,however,they decreased to(0.148±0.019)(P＜0.01)and(0.078±0.021)(P＜0.01)in DU145 and PC3 cells infected with virus carrying D5 Stat5a cDNA at MOI 30, respectively.Increased trimethylation on histone 3 lysine 27(H3K27Me3)of IGFBP-7 gene promoter region and downregulated IGFBP-7 expression were also found in prostate cancer cells over-expressing D5 Stat5a including DU145 and PC3 cells.ChIP assay showed that the percentage of immunoprecipitated DNA in control cells and cells infected with D5 Stat5a cDNA adenovirus at MOI 30 were(0.0176±0.0030)%and(0.0650±0.0099)%(P＜0.01)respectively in DU145 cells.Additionally,over-expression of D5 Stat5a up-regulates the expression of EZH2.The relative EZH2 mRNA in control cells and cells(DU145)infected with virus carrying D5 Stat5a at MOI 30 were(0.0033±0.0004)and (0.0160±0.0035)(P＜0.05),respectively.ConclusionD5 Stat5a promotes proliferation of prostate cancer cells through, at least partly,up-regulation of EZH2 expression followed by trimethylation of H3K27(H3K27Me3)and inhibition IGFBP-7 gene expression,which is one of the molecular mechanism of abnormal proliferation of prostate cancer cells.

D5 Stat5a;Prostate cancer cells;Epigenetics;Histone trimethylation;Chromatin immuneprecipitation assay

RQ7；R73［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0007-07

2014-11-24本文編輯：程銘）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號81172497，81260396）。

聶璽（1981.8-），女，吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：乳腺癌的分子機(jī)制。

［作者簡介］譚敦勇（1958.2-），男，醫(yī)學(xué)博士，教授，美國心臟病學(xué)會會員及美國內(nèi)分泌學(xué)會會員；研究方向：生殖系統(tǒng)腫瘤的分子生物學(xué)。