梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

劉 兵馮文莉*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科，山西 太原 030001）

梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

劉 兵1馮文莉2*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科，山西 太原 030001）

梅毒是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的性傳播疾病，臨床上主要借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行診斷。近年來(lái)，快速、靈敏和特異性高的檢測(cè)方法在不斷更新完善中。本文主要從病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)、腦脊液四方面對(duì)梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷的最新進(jìn)展作一綜述。

梅毒；病原體；血清學(xué)；分子生物學(xué)；腦脊液

梅毒（syphilis）是由蒼白密螺旋體的蒼白亞種即梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）所引起的一種慢性、接觸性傳染病，近年來(lái)其發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)[1]。TP由Fritz Schaudinn和Erich Hoffmann于1905年首次發(fā)現(xiàn)，為纖細(xì)的密螺旋體，運(yùn)動(dòng)活潑，可以旋轉(zhuǎn)、蛇行、伸縮三種方式運(yùn)動(dòng)，感染機(jī)體后可產(chǎn)生兩類(lèi)抗體：一類(lèi)為非特異性抗體，該類(lèi)抗體能與廣泛分布于生物組織中的類(lèi)脂抗原發(fā)生非特異性反應(yīng)；另一類(lèi)為特異性抗體。針對(duì)TP生物學(xué)及免疫學(xué)特性，梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要是從病原體、血清學(xué)、分子生物學(xué)、腦脊液四方面開(kāi)展。

1 病原體直接檢測(cè)

1.1 暗視野顯微鏡檢查T(mén)P（DF）：暗視野顯微鏡可直接觀察到病灶分泌物中運(yùn)動(dòng)活躍的蒼白螺旋體，結(jié)合臨床癥狀可直接診斷梅毒。該法操作簡(jiǎn)單，且經(jīng)濟(jì)、快速，但敏感性較低，檢測(cè)陽(yáng)性率為65%～70%，主要受病程、某些外加因素以及檢測(cè)人員技術(shù)水平影響，而且對(duì)部分二期梅毒皮疹、隱性梅毒或口腔病灶標(biāo)本不適用。

1.2 鍍銀染色方法檢查T(mén)P（Wartbin starry）：由于TP具有親銀性，可將TP染成棕褐色或黑褐色，且層次清楚，反差明顯，形態(tài)清晰，背景為黃色，TP易被著色辨認(rèn)，封片后可以永久保存標(biāo)本。缺點(diǎn)是鍍銀染色液需新鮮配制，且不能觀察TP的運(yùn)動(dòng)方式，易與類(lèi)似TP的其他物質(zhì)混淆，故臨床應(yīng)用很少，多用于科研和教學(xué)。

1.3 免疫熒光抗體染色：該法將TP用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗TP抗體或單克隆抗體染色，利用抗原抗體特異性反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)綠色熒光，表明檢測(cè)標(biāo)本中含有TP，但需要熒光顯微鏡設(shè)備，技術(shù)條件要求較高。

2 梅毒血清學(xué)檢測(cè)

梅毒血清學(xué)檢測(cè)根據(jù)所用抗原不同可分為非特異性抗體檢測(cè)和特異性抗體檢測(cè)兩大類(lèi)[2]。

2.1 非特異性抗體檢測(cè)

2.1.1 康瓦試驗(yàn)：是最早檢測(cè)梅毒患者體內(nèi)抗體的方法，這種試驗(yàn)的抗原采自牛心肌粉酒精浸液。此試驗(yàn)操作復(fù)雜，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，目前這種試驗(yàn)已被臨床淘汰。

2.1.2 性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）：該法屬于微量玻片法，以心磷脂為抗原，加入膽固醇增強(qiáng)靈敏性和加入卵磷脂以提高抗原性，定性及定量檢測(cè)血清中的抗類(lèi)脂質(zhì)抗原的非特異性抗體。該實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速，2 h內(nèi)出結(jié)果。但是技術(shù)要求高，抗原懸液不穩(wěn)定，要求待測(cè)血清新鮮而且需要加熱滅活，結(jié)果需要借助顯微鏡觀察。

2.1.3 不加熱血清反應(yīng)素玻片試驗(yàn)（USR）：本法是VDRL檢測(cè)技術(shù)改良后的方法，改良措施是在抗原懸液中加入了二胺四乙酸二鈉滅活補(bǔ)體從而使懸液更加穩(wěn)定可保存4個(gè)月，又在懸液中加入了氯化膽堿可對(duì)待測(cè)血清直接化學(xué)滅活從而減少了加熱滅活步驟，從而在檢測(cè)時(shí)更加快速、方便。缺點(diǎn)是需要借助顯微鏡，主觀性強(qiáng)，易出現(xiàn)漏檢。

2.1.4 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）：利用從牛心中提取出來(lái)的有效成分—心磷脂、卵磷脂及膽固醇組成抗原，然后用特制的活性炭顆粒進(jìn)行吸附，通過(guò)肉眼觀察白色紙板上有無(wú)黑色凝集顆粒出現(xiàn)而直接進(jìn)行結(jié)果判斷。該方法操作簡(jiǎn)便、迅速，適用于大批量標(biāo)本檢測(cè)。缺點(diǎn)是當(dāng)抗體含量過(guò)高時(shí)，易出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，即前帶現(xiàn)象（promne phenomenon），會(huì)有漏檢；還易出現(xiàn)生物學(xué)假陽(yáng)性反應(yīng)，但是RPR試驗(yàn)可檢測(cè)抗體滴度變化，RPR滴度變化是觀察治療效果、復(fù)發(fā)或再感染的重要指標(biāo)。

2.1.5 甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)（TRUST）：該法用類(lèi)脂質(zhì)（從牛心提取的心磷脂和從雞蛋黃提取的卵磷脂及膽固醇）為抗原來(lái)檢測(cè)血清中的抗類(lèi)脂質(zhì)抗體，原理與RPR試驗(yàn)類(lèi)似，只是以甲苯胺紅染料顆粒代替活性炭顆粒做吸附劑。試驗(yàn)結(jié)果清晰易讀，簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定性好，但對(duì)一期梅毒、三期梅毒及隱性梅毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，尤其是三期梅毒。

2.2 特異性抗體檢測(cè)

2.2.1 熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）：試驗(yàn)以非致病性密螺旋體Reiter株作為抗原來(lái)吸收待測(cè)血清，排除了同屬抗原交叉結(jié)合的可能性，特異性好。而且該法因采用了整條螺旋體進(jìn)行檢測(cè)，敏感性高。文獻(xiàn)報(bào)道FTA-ABS對(duì)各期梅毒檢測(cè)的特異性達(dá)到92%，對(duì)一期梅毒的敏感性為80%，二期為99%～100%，三期為95%～100%[3]；缺點(diǎn)是使用了活菌，存在一定的潛在危險(xiǎn)性。而且需要使用熒光顯微鏡，對(duì)設(shè)備和操作要求較高，所以該法的使用受到了限制。

2.2.2 TP血球凝集試驗(yàn)（TPHA）：用羊或火雞紅細(xì)胞做抗原載體，吸附從兔睪丸中提取的粗制TP粉碎物抗原，檢測(cè)血清中TP特異性抗體。由于試劑制備過(guò)程排除了各種非特異性反應(yīng)，敏感性和特異性均較高。但試劑成本較高，操作較麻煩，且易發(fā)生自凝現(xiàn)象和生物學(xué)假陽(yáng)性[4]。

2.2.3 TP明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）：主要是把致病性TP的精致菌株成分包被在人工載體明膠粒子上檢測(cè)血清中相應(yīng)的抗體，該試驗(yàn)是TPHA的改良方法。姜澤升[5]對(duì)98例梅毒患者給予TPPA檢測(cè)后，其合計(jì)陽(yáng)性率為100%，結(jié)果表明TPPA具有敏感性高、特異性高等特點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)公認(rèn)的梅毒確證方法，梅毒確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。但因其操作復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不易保存且出具滴度結(jié)果時(shí)成本較高，故臨床上TPPA常用于對(duì)篩檢為陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行確診。

2.2.4 TP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELLISA）：該法采用基因工程體外表達(dá)得到的TP特異抗原（常用TpN47 TpN15 TpN17）包被微孔滴定板，同時(shí)檢測(cè)血清中的抗TP-IgM和抗TP-IgG抗體，利用酶的放大效應(yīng)，提高檢測(cè)的靈敏度，因采用了純化的基因重組抗原，提高了其檢測(cè)的特異性。在低危人群中篩查的靈敏度可達(dá)到93.8%～99%，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[7]。Sun[8]報(bào)道TP嵌合基因重組抗原（TpN15-47-17）及單一抗原TpN47 TpN15 TpN17分別構(gòu)建雙抗原夾心ELISA，平行檢測(cè)965份梅毒陽(yáng)性血清，結(jié)果證實(shí)前者比后者敏感度提高。由于此法操作簡(jiǎn)便，不受樣本纖維蛋白和溶血等影響，一次可完成多份標(biāo)本的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果由儀器分析，客觀而準(zhǔn)確，特別適用于大批血源標(biāo)本的篩檢。

2.2.5 TP膠體金試驗(yàn)（CGT）：運(yùn)用雙抗原夾心法的原理，以膠體金作為標(biāo)志物，用特異性TP抗原作為包被和標(biāo)記抗原，在硝酸纖維素膜上進(jìn)行反應(yīng)來(lái)檢測(cè)待測(cè)血清中的TP特異性抗體。Nessa[9]用此法檢測(cè)684份女性性工作者，與TPPA方法相比較，靈敏度為94.45%，特異性為92.6%，認(rèn)為這是一種非侵襲性的梅毒快速篩查方法。Lin[10]等采用優(yōu)化了的具有梅毒特異性的重組蛋白TPN17和TPN47作為標(biāo)記抗原，建立檢測(cè)血清中梅毒抗體IgM的TP金標(biāo)法，經(jīng)過(guò)多年的驗(yàn)證，其敏感性、特異性分別為98.21%和99.04%。

2.2.6 蛋白印跡試驗(yàn)（WB）：該試驗(yàn)是通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜抗原條上含有TP的各種成分來(lái)確認(rèn)是否梅毒感染。近年來(lái)多采用具有高度免疫原性重組多肽抗原進(jìn)行檢測(cè)，有更好的敏感性和特異性。Welch[11]報(bào)道WB法用于梅毒確認(rèn)試驗(yàn)優(yōu)于TPPA，對(duì)二期梅毒、早期梅毒、神經(jīng)梅毒陽(yáng)性率為100%。對(duì)于生物學(xué)假陽(yáng)性標(biāo)本、r球蛋白增高和自身抗體的標(biāo)本檢測(cè)沒(méi)有假陽(yáng)性和可疑反應(yīng)。

2.2.7 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CLIA）。該法的原理為：標(biāo)本或包被有重組TP抗原的微粒子與稀釋液混合后，標(biāo)本中的抗TP抗體同微粒子上包被的TP抗原結(jié)合，清洗后，加入標(biāo)記吖啶脂（acridinium）的抗人IgM或IgG抗體，在進(jìn)行另一步洗滌程序后，加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液的相對(duì)光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)血清TP特異性抗體水平。該法從檢測(cè)到結(jié)果判定均由儀器自動(dòng)完成，操作方便，人為干擾少，結(jié)果客觀準(zhǔn)確。Antonella[12]等用RPR、CLIA、TPHA、WB、ELISA五種方法對(duì)131份梅毒血清進(jìn)行水平檢測(cè)，CLIA法的敏感性最高，為99.2%，由此可見(jiàn)該法在梅毒特異性抗體檢測(cè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.3 基因診斷技術(shù)檢測(cè)：近年來(lái)，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。PCR是一種體外擴(kuò)增DNA技術(shù)。當(dāng)存在模板DNA、底物、上下游引物和耐熱DNA聚合酶時(shí)，經(jīng)過(guò)多次變性、復(fù)性、延伸反應(yīng)的循環(huán)過(guò)程，模板DNA就可得到大量擴(kuò)增。進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇特異性高的靶基因是DNA擴(kuò)增首先考慮的問(wèn)題。目前已有幾套擴(kuò)增梅毒螺旋體DNA的基因如47ku、39ku（bmp）、TPF1 tmpA、tmpB、PolA編碼基因[13]。但是除梅毒螺旋體DNA多聚酶Ⅰ基因（TP-PorA）特異性較高外，大部分與其他微生物具有一定的同源性，特異性還不理想[14-15]。梅毒PCR檢測(cè)方法有常規(guī)PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR和實(shí)時(shí)PCR。常規(guī)PCR只需要設(shè)計(jì)一對(duì)相應(yīng)的引物，擴(kuò)增后需做凝膠電泳鑒定，故操作比較繁瑣，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物極易受到污染造成假陽(yáng)性。巢式PCR先用一對(duì)外引物進(jìn)行第一輪PCR，然后再使用第一對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，因其采用2對(duì)引物進(jìn)行2輪擴(kuò)增，因此敏感性和特異性均有所增強(qiáng)[16]。逆轉(zhuǎn)錄PCR是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。用于逆轉(zhuǎn)錄PCR設(shè)計(jì)引物的靶基因是16srRNA，也需要Southern印跡雜交試驗(yàn)來(lái)保證其特異性，因此，操作比較繁瑣，臨床上不常使用。多重PCR是在同一個(gè)反應(yīng)管中用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾條DNA片段，目前常用于與其他病原體同時(shí)檢測(cè)[17]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用對(duì)熒光信號(hào)積累的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[18]。由于PCR是直接檢測(cè)TP-DNA，所以其檢測(cè)的敏感勝和特異性均高于血清學(xué)檢測(cè)，此外，良好的特異性使PCR技術(shù)在鑒別梅毒與其他螺旋體感染時(shí)顯現(xiàn)了其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。PCR檢測(cè)尤其適用于微量TP檢測(cè)，如先天性梅毒、早期梅毒。這是因?yàn)槿梭w感染TP后要到4～10周才產(chǎn)生一定水平的抗體，特異性抗體比非特異性抗體早約1周出現(xiàn)；缺點(diǎn)是PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性較高，檢測(cè)敏感性會(huì)受標(biāo)本來(lái)源和所處病期的限制。此外，PCR檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員有一定的要求，且檢測(cè)成本較高。因此，PCR不能替代血清學(xué)檢測(cè)，只能作為血清學(xué)檢測(cè)的補(bǔ)充。

2.4 腦脊液的檢查：用于診斷神經(jīng)梅毒，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白定量、VDRL、PCR檢測(cè)和膠體金法。腦脊液細(xì)胞數(shù)和總蛋白量增加不是一種特異性反應(yīng)，只有腦脊液VDRL試驗(yàn)才是神經(jīng)梅毒的可靠性診斷依據(jù)[19]。

3 展 望

梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)眾多，但是每種方法都存在一定的局限性，綜合考慮利弊，不難得出血清學(xué)檢測(cè)方法仍然是梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷的主要方法，而且隨著近幾年分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以重組抗原作為診斷抗原的特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便、低成本的血清學(xué)方法是發(fā)展趨勢(shì)，但是目前重組抗原仍不能用于臨床各期梅毒，需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)其他新的重組抗原在梅毒診斷中的意義，從而尋求一種在檢測(cè)各期梅毒時(shí)靈敏度和特異度都能達(dá)到“金標(biāo)準(zhǔn)”所要求的百分比的重組抗原，這將為梅毒患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療帶來(lái)前所未有的前景。

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R759.1

A

1671-8194（2015）07-0048-03

山西省軟科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（編號(hào)：2011041073-02）

*通訊作者：E-mail： fwl192@hotmail.com