應用2215細胞研究中藥抗乙肝病毒的進展

傅超,李晨

(1.青島市食品藥品檢驗檢測中心，山東 青島 266071；2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034)

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應用2215細胞研究中藥抗乙肝病毒的進展

傅超1,李晨2

(1.青島市食品藥品檢驗檢測中心，山東 青島 266071；2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034)

目的 應用2215細胞作為藥物體外篩選模型目前已發(fā)展到比較成熟的階段，按照現(xiàn)有實驗對不同藥物處理方法分類，本文歸納總結中草藥、中藥提取物、中成藥以及含藥血清等應用2215細胞進行抗乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的實驗研究現(xiàn)狀，為中藥抗乙肝病毒的研究和開發(fā)提供了參考。

2215細胞；中藥；抗乙肝病毒；研究進展

乙型肝炎是一種嚴重影響我國以及世界人類健康和生活質(zhì)量的疾病。目前，西藥治療乙肝存在大量問題，諸如缺乏特效藥，不良反應多，藥物依賴性強和價格昂貴等。HBV感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生有著密切因果關系[1]，從現(xiàn)有療效確切的我國傳統(tǒng)中藥中尋找抗乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的活性物質(zhì)具有重要的學術和應用價值。

體外細胞培養(yǎng)是篩選抗HBV藥物的有用工具。2215細胞模型是Sells 等[2]在1987年將克隆的2個頭尾相連的HBV DNA全基因及抗G418質(zhì)粒直接導入受體細胞——人肝癌細胞株 (liver hepatocellular cells，HepG2)細胞構建而成。目前，該細胞模型已被國內(nèi)外學者公認且廣泛用于抗HBV 藥物篩選和評價等研究，現(xiàn)已成為申報抗HBV 新藥必須進行的體外實驗模型[3]。

現(xiàn)就中草藥的不同處理方法對2215細胞分泌乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)影響的實驗進展作以下綜述。

1 中草藥及提取物

在對中草藥的篩選中，葉下珠顯示出較好的抗HBV作用。國內(nèi)外均有不同品種葉下珠抗病毒作用比較的報道[4-5]。臺灣細葉油柑(PhyllanthussimplexRetz.)為葉下珠屬植物，黃正昌等[6]應用2215細胞株及雛鴨乙型肝炎模型，對臺灣細葉油柑水提取物和醇提取物進行了體內(nèi)外抗乙肝活性實驗。實驗結果顯示，臺灣細葉油柑水提取物和醇提取物對HBsAg分泌均有一定抑制作用，但其醇提物對HBeAg的分泌無抑制作用。在體內(nèi)抗鴨乙肝病毒實驗中，臺灣細葉油柑水提物10 g/(kg·d)和5 g/(kg·d)劑量組于給藥5 d、給藥10 d和停藥3 d時有顯著體內(nèi)抑制鴨乙型肝炎病毒核酸(duck hepatitis B virus DNA，DHBV-DNA)作用，而其醇提物則無抑制DHBV-DNA作用。提示臺灣細葉油柑水提取物有抗乙肝病毒作用。

大蒜多糖(garlic polysaccharide，GP)是從大蒜球根中提取的活性成分，具有抗氧化、抑制肝癌細胞生長等作用[7]，鄭敏等[8]在2215細胞接種24h后加入大蒜多糖A、B、C，以ELISA法檢測HBeAg與HBsAg，并用MTT染色法觀察藥物的細胞毒性。結果發(fā)現(xiàn)大蒜多糖A、B、C對2215細胞半數(shù)毒性濃度分別為110.53、108.65及16.00 mg/mL；可劑量依賴性抑制HBsAg的分泌，其半數(shù)抑制濃度(half inhibition concentration，IC50)分別為9.31、21.30和1.31 mg/mL，治療指數(shù)分別為11.87、5.10和12.21，對HBeAg的分泌則均無明顯抑制作用，即得出大蒜多糖A、B、C在培養(yǎng)2215細胞中可抑制HBsAg的分泌的結論。

芒果苷系芒果葉的主要有效成分。據(jù)報道芒果苷具有保肝利膽、平喘鎮(zhèn)咳、抗病毒等作用。運晨霞等[9]以Western blot檢測芒果苷對2215細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號轉(zhuǎn)導通路中、 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terrninal Kinase,JNK/ c-Jun)、p38蛋白含量及磷酸化水平的作用，以報告基因?qū)嶒灆z測芒果苷對2215細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(activator protein-1，AP-1)活性影響，結果顯示，芒果苷對2215細胞MAPK信號轉(zhuǎn)導通路中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平無明顯作用，但可以抑制JNK蛋白和其下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活性，認為芒果苷通過MAPK信號轉(zhuǎn)導通路抑制HBV在肝細胞內(nèi)復制。

葡萄科蛇葡萄屬藥用植物大葉蛇葡萄(AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg.)具有保肝等作用[10]，陳梅玲等[11]將大葉蛇葡萄乙醇提取物作用于乙肝病毒DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系2215細胞，以細胞病變(cytopathic effect，CPE)觀察藥物對2215細胞的毒性，用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定藥物對培養(yǎng)8天的2215細胞分泌的HBsAg和HBeAg表達抑制作用。結果大葉蛇葡萄提取物半數(shù)中毒濃度(median toxic concentration，TC50)為250 μg/mL，最大無毒濃度(maximal atoxic concentration，TC0)為125 μg/mL；其對細胞HBsAg和HBeAg抑制的IC50為43.1 μg/mL、54.8 μg/mL，治療指數(shù)(therapeutic index，TI)為5.8、4.7，表明大葉蛇葡萄乙醇提取物具有一定的體外抗乙肝病毒作用。

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand—Mazz)w．Y．Wang]的嫩莖葉，其主要成分是黃酮類化合物，含量約為45.52%。研究表明，藤茶總黃酮對2215細胞HBsAg、HBeAg的分泌有明顯抑制作用[12]。雙氫楊梅樹皮素 (dihydromyricetin ampelosis，DHM)為藤茶總黃酮中含量最多的一種單體成分，鄭作文等[13]接種2215細胞24h后，加入DHM培養(yǎng)，觀察 DHM對細胞的毒性，在無毒質(zhì)量濃度下，將藥物加入2215細胞培養(yǎng)，ELISA法測定培養(yǎng)液中 HBsAg和 HBeAg水平。結果在最大無毒質(zhì)量濃度下，DHM對2215細胞分泌 HBsAg及 HBeAg具有明顯的抑制作用。對于 HBsAg，DHM IC50為 l7.7 μg/mL， TI為15.4；對于HBeAg，IC50為21.8 μg/mL，TI為12.5。DHM 對2215細胞分泌 HBsAg及 HBeAg有明顯的抑制作用。

升麻具有清熱解毒、升舉陽氣功能，主治頭痛、牙痛、口瘡、咽喉腫痛等證，體內(nèi)外藥理試驗表明升麻中酚酸性成分具有明顯抗病毒作用，劉方舟等[14]采用2215細胞模型進行體外實驗，對細胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA含量進行檢測，評價升麻中提取物SMT 75%乙醇提取物、SMT總皂苷、SMT總有機酸體外抗乙肝病毒作用，結果顯示升麻提取物對2215細胞HBeAg、HBV-DNA分泌有一定抑制作用，其中升麻總皂苷的0.018，0.036 g劑量組，升麻總有機酸的0.02 g劑量組對HBeAg、HBV-DNA分泌與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

白背葉為大戟科植物Mallotusapelta(Lour.)Muel-Arg，臨床常用于治療肝炎。夏星等[15]以不同濃度的白背葉提取物培養(yǎng)接種24 h的2215細胞8 d，評價細胞形態(tài)學上的細胞毒性，酶聯(lián)免疫法檢測最大無毒濃度下的培養(yǎng)液中HBsAg和HBeAg水平，結果白背葉提取物對2215細胞HBeAg、HBsAg分泌有顯著抑制作用，其中抑制HBsAg的IC50為8.61 μg/mL，抑制HBeAg的IC50為20.87 μg/mL。

爵床科植物六月青Goldfussiapsilostachys(C.B.Clarke ex W.W.Smith)Brem總皂苷成分可以抑制鴨乙肝病毒[16-17]。林興等[18]以六月青總皂苷培養(yǎng)接種過的2215細胞，拉米夫定作為陽性對照，MTT法檢測藥物抗HBV作用，結果其對培養(yǎng)液中HBeAg分泌及HBV-DNA的復制具有明顯抑制作用，呈顯著的濃度-效應和時間-效應關系；對HBsAg的IC50為9.45 mg/L，TI為36.98，抗HBV作用顯著。

2 中藥復方

復方黃根片、復方三姐妹片等8個中藥復方，是具有廣西特色的抗慢性乙型病毒性肝炎的復方。鄧家剛等[19]通過觀察這8個中藥復方對2215細胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，篩選出體外可能抗乙肝病毒的復方。實驗應用MTT法對8個中藥復方進行細胞毒性實驗，在無毒濃度下分別檢測8個中藥復方對細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。復方黃根片最TC0為1375 μg/mL，對細胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為29.85%，89.99%；復方三姐妹片的TC0為1250 μg/mL，對細胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為1.69%，80.78%；復肝湯的TC0為730.05 μg/mL，對細胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為33.09%，40.98%；護肝解毒丸的TC0為2700 μg/mL，對細胞分泌的HBsAg沒有作用，對HBeAg抑制率為64.16%；達肝清顆粒的TC0為626.2 μg/mL，對細胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為3.70%，43.83%；柴胡四草湯的TC0為278.91 μg/mL；壯肝散的TC0為3281.25 μg/mL；健脾利濕方的TC0為976.56 μg/mL。結果發(fā)現(xiàn)復方黃根片、復方三姐妹片、護肝解毒丸、復肝湯對HBeAg有較強的抑制作用，對HBsAg的抑制作用比較弱；達肝清顆粒對HBeAg有一定的抑制作用，對HBsAg的抑制作用比較弱；柴胡四草湯、壯肝散、健脾利濕方對HBeAg，HBsAg幾乎沒有抑制作用。

海珠益肝膠囊的組方主要由葉下珠、海藻等中藥組成，具有清熱解毒、化痰消瘀之功效，經(jīng)臨床應用有良好的療效[20]。宴雪生等[21]通過細胞毒性實驗以確定對2215細胞無毒性作用的最高藥物濃度，直接加藥物到細胞培養(yǎng)液中，用固相放射免疫方法測定其HBsAg、HBeAg含量。結果表明海珠益肝膠囊TC0<1.25 mg/mL，海珠益肝膠囊有明顯抑制HBsAg、HBeAg的作用，各濃度間存在量效關系，其中對HBeAg的作用優(yōu)于對HBsAg的作用。得知海珠乙肝膠囊對2215細胞HBV標志物有顯著的抑制作用。

復方肝舒康由馬鞭草、移星草、巴戟天、人參等十二味中藥組成，臨床治療病毒性肝炎有顯著療效。李虹霖等[22]以復方肝舒康各提取部位作用于HBV轉(zhuǎn)染的2215細胞，酶聯(lián)免疫法檢測其對HBsAg和HBeAg的抑制作用，結果復方肝舒康乙酸乙酯提取物對HBsAg半數(shù)有效濃度IC50為14.0 μg/mL，治療指數(shù)26.7；對HBeAg的IC50為19.7 μg/mL，治療指數(shù)19.04。說明復方肝舒康抗HBV作用明顯，其作用的物質(zhì)基礎是乙酸乙酯部位。

蛇黃肝炎合劑由白花蛇舌草、田基黃、蒲公英、黃芪等九味藥物組成，具有清熱解毒、益氣護肝等功效，孔祥廉等[23]以HBV轉(zhuǎn)染的人2215細胞株為靶細胞，通過體外細胞培養(yǎng)實驗觀察其對HBV分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，結果蛇黃肝炎合劑在1:16倍稀釋時對細胞的破壞率為63.49%，無毒濃度1:32倍稀釋下能抑制HBsAg達64.83%，抑制細胞分泌HBeAg達86.1%，提示本藥物為2215細胞分泌HBsAg和HBeAg抑制作用顯著。

壯藥汗衣臺為防己科植物皺波青牛膽的(Tinosporacrispa(L.)Miers)的藤莖。該屬植物在印度、泰國等東南亞國家被廣泛藥用，具有通經(jīng)活血、清熱排毒等作用[24]。廖丹等[25]以不同濃度汗衣臺及其配伍藥孵育2215細胞，ELISA法測定分泌HBsAg和HBeAg含量，熒光定量檢測HBV-DNA，結果復方(P<0.01)與汗衣臺單用(P<0.05)均有抑制HBeAg以及HBV-DNA分泌的作用。

3 含藥血清

中藥血清藥理學方法是近年來興起的一種適合中藥特點的更科學的中藥藥理學實驗方法。它可防止中藥制劑本身的理化性質(zhì)對實驗的干擾，還能模擬反映中藥在胃腸道消化吸收、再經(jīng)生物轉(zhuǎn)化、最后產(chǎn)生藥理效應的真實過程，并代表了藥物在體內(nèi)產(chǎn)生作用的真正有效成分，尤其是適用于中藥及中藥復方化學成分復雜的特點，由于體外試驗存在著一定的局限性，體內(nèi)試驗模擬難度大，近年來已有越來越多學者趨向于利用血清藥理學對中藥抗HBV的作用進行研究。

李剛等[26]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測藤茶總黃酮含藥血清對2215細胞分泌的HBsAg和HBeAg的抑制作用。藤茶總黃酮含藥血清能顯著抑制2215細胞HBsAg、HBeAg的分泌，20%、10%藤茶總黃酮含藥血清對2215細胞HBsAg和HBeAg的分泌有非常顯著的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

壯藥依肝達是通過長期的民間臨床觀察而擬定的治療急慢性乙型肝炎和肝硬化的驗方， 主要由壯族民間草藥飯湯子、田基黃、三姐妹等組成，，具有清熱解毒、利濕退黃和促進肝功能恢復之功效，臨床療效顯著。梁寧等[27]采用ELISA法檢測依肝達含藥血清對2215細胞分泌的 HBsAg和HBeAg的抑制作用。實驗結果表明，依肝達含藥血清 (20%、10%)明顯降低2215細胞分泌的 HBsAg、HBeAg抗原水平(P< 0.01)，與陽性組無明顯差別。

苦玄參為玄參科植物苦玄參(PicriafeltarraeLour)的干燥全草，曾金強等[28]以苦玄參不同提取部位含藥血清作用于2215細胞，用酶聯(lián)免疫法測定HBsAg和HBeAg水平，發(fā)現(xiàn)各提取部位對HBsAg均有抑制作用；乙醇提取部位、水提取部位等極性較大成分對HBeAg的抑制作用明顯，抑制率最高達80%。

4 討論

目前對于乙肝病的治療，研究方法主要集中在抗病毒上。HBV是一種較為嚴格的嗜肝DNA病毒，由于病毒黏附以及DNA轉(zhuǎn)錄和復制對宿主有嚴格的要求，HBV只感染人類和類人猿。對HBV的研究由于缺乏合適的可利用的動物模型而受到一定限制[29]。現(xiàn)階段中藥抗HBV效果大多利用HepG2215細胞株和以嗜肝DNA病毒感染動物這2種模型來評價[30]，應用2215細胞作為藥物體外篩選模型，與以往的體內(nèi)試驗相比，該方法簡便可行，可以為抗HBV藥物的篩選從另一個角度提供一定的信息。但體外實驗研究結果不能完全反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)和體內(nèi)代謝對藥物效果的影響，進一步證實藥物抗病毒作用還須結合體內(nèi)實驗來確定。筆者認為，抗乙肝病毒的體外研究應通過中藥化學、分析化學、生物化學、免疫學、細胞藥理學及分子生物學等多學科理論和技術加以研究，并緊密結合中醫(yī)藥的基礎理論，以使其更系統(tǒng)化。

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(編校：王冬梅)

Research progress of 2215 cell in hepatitis B virus resistance tests for traditional Chinese medicine

FU Chao1,LI Chen2

(1.Qingdao Center for Food and Drug Control, Qingdao 266071, China; 2.Qingdao FuWai Hospital of Cardiovascular Disease, Qingdao 266034, China)

Using 2215 cells for drug screening in vitro model at present has developed to the mature stage.According to the different ways to deal with existing experiment of drug classification.In this paper, the research status of 2215 cells in hepatitis B virus (HBV) resistance experiment for Chinese herbal medicine, Chinese medicine extract, proprietary Chinese medicine and the drug-containing serum were summarized to provide the reference for research and development of traditional Chinese medicine for anti HBV .

2215 cells; traditional Chinese medicine (TCM); anti-HBV; research progress

傅超，男，碩士，主管藥師，研究方向；藥品檢驗，E-mail：alexandar_2026@sina.com。

R965.1

A

1005-1678(2015)02-0180-04