豬傳染性胃腸炎病毒基因及疫苗研究進展

李明舉 由佳 彭蕓蕓 （山東省煙臺市動物疫病預防與控制中心 264003）

豬傳染性胃腸炎病毒基因及疫苗研究進展

李明舉 由佳 彭蕓蕓 （山東省煙臺市動物疫病預防與控制中心 264003）

豬傳染性胃腸炎是危害全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。預防和控制該病的主要措施之一就是疫苗接種，目前分子生物學技術發(fā)展迅速，對TGEV的研究取得了較大進展，本文主要對近年來該病毒疫苗的研究進展進行了深入概括闡述，為進一步做好該病防控工作貢獻微薄之力。

豬傳染性胃腸炎；基因組結構；基因工程疫苗；研究進展；綜述

豬傳染性胃腸炎 （Transmissible gastro enteritis，TGE）是豬的一種高度接觸性腸道疾病，以嘔吐、嚴重腹瀉和脫水為特征。各種年齡豬均可發(fā)病，2周齡以內仔豬病死率高達100%，5周齡以上豬的病死率較低，成年豬幾乎沒有死亡。1946年首次由Doyle和Hutchings在美國報道發(fā)生TGE，1956年的日本和1957年的英國也先后報道該病，隨后歐洲、北美、亞洲等多個國家相繼報道，TGE已成為豬一種世界性疾病。中國從60年代開始就有TGE的報道，近些年該病有進一步擴大流行趨勢，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)常呈地方性暴發(fā)流行，TGE仍是現今引起仔豬發(fā)病和死亡的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大困擾[1,2]。在 《國際動物衛(wèi)生法典》中，TGE已經被列入國家B類傳染病，是我國法定重點防控的疫病之一。

1 基因組結構

TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA，其5’端有帽子結構，3’端有poly（A）尾，基因組與核蛋白相結合，具有感染性。整個基因組全長約為2.85×104bp，分子質量為6×103ku，分為7個區(qū)，每個區(qū)有一個或兩個開放閱讀框（ORFs），亞基因組mRNAs之間有保守序列將其分開，基因組結構為5’-ORF1a-ORF1b-S（ORF2）-ORF3a-ORF3b-sM（ORF4） -M （ORF5） -N （ORF6） -ORF7-3’ 。 ORF2、ORF4、ORF5和ORF6分別編碼病毒的纖突 （S）蛋白、小膜（sM） 蛋白、 膜 （M） 蛋白和核衣殼 （N） 蛋白[3]，ORF1a和ORF1b編碼病毒的聚合酶。ORF1a上游有一個3個密碼子長的ORF （upstream ORF，uORF）， 對ORF1a和ORF1b轉譯起調控作用，最大的非編碼區(qū)為位于3’端ORF7基因下游不含poly（A）的280個核苷酸。研究表明，TGEV基因組具有很高的重組率，這一現象類似于分節(jié)段的RNA病毒[4,5]。

2 疫苗研究進展

由冠狀病毒引發(fā)的TGE感染，目前仍缺乏有效的臨床藥物，采用疫苗進行免疫接種是主要的預防措施。多年來，研究人員一直致力于TGEV的免疫控制技術研究，期間大致經歷了強毒疫苗、弱毒疫苗、滅活疫苗和基因工程疫苗四個階段。

2.1 強毒疫苗

TGE具有高度傳染性，一旦爆發(fā)此病，可造成新生仔豬100%死亡，損失極其嚴重。最初人們采用發(fā)病豬的腸內容物和糞便感染全場妊娠母豬使其產生免疫力，從而使仔豬獲得顯著保護率。Moxley等曾采用以強毒人工免疫方法免疫仔豬，感染仔豬死亡率明顯降低。但該法使豬場場地嚴重污染，強毒持續(xù)存在，腹瀉發(fā)病率雖降低，但常年發(fā)病，此法現已被禁止。

2.2 滅活疫苗

2007年，賈華強分離到TB（中國豬傳染性胃腸炎病毒株強毒株），適應細胞后用低代次毒的細胞培養(yǎng)物經甲醛滅活后，分別制備了油包水乳化苗和氫氧化鋁吸附苗，豬體試驗結果顯示豬體保護率超過80%[6]。滅活疫苗雖然安全有效，但其誘導的免疫應答產生較慢 （15d左右），且不能激發(fā)產生以slgA抗體為主的粘膜免疫反應，制苗成本比較昂貴。

2.3 弱毒疫苗

TGEV弱毒疫苗主要包括北美TGE-VAC、匈牙利CKP和日本TO-163疫苗株[7]。該疫苗對TGE預防工作起到了重要作用，能刺激產生粘膜免疫反應，肌注產生抗體快、水平高，歐美主要使用弱毒疫苗。國外學者Aynaud將TGEV突變株188-SG致弱分別通過口服、肌肉注射、眼結膜途徑免疫妊娠母豬，從而使哺乳仔豬得到保護。但TGEV弱毒疫苗同樣具有其他弱毒疫苗所存在的易凡返祖、有潛在感染危險等缺陷。臨床上將弱毒苗和滅活苗一起使用，可產生較好的保護效果。

2.4 基因工程疫苗

隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，基因工程疫苗以成本低、生產簡單、存儲方便等優(yōu)勢倍受人們青睞，各種TGEV基因工程疫苗的研究得到了突飛猛進的發(fā)展。完整的TGEV包含4種結構蛋白，纖突蛋白 （S）、小膜 （sM）蛋白、膜（M）蛋白和核衣殼 （N）。纖突蛋白 （S）和N蛋白是目前TGE基因工程疫苗的研究靶點。

2.4.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗中含有特殊的高分子，可誘導產生抵抗病原體的免疫保護作用，從而產生良好的免疫效果。由于TGE冠狀病毒的S蛋白具有良好的免疫原性和腸道內較強的抗降解能力，因此它成為發(fā)展哺乳動物腸道病原體口服疫苗非常好的模型。2004年，Streatfield等人以谷物作為載體表達TGEV S蛋白，制備的亞單位疫苗可有效提高母豬血清以及初乳的中和抗體水平，提高了免疫效果[8]。

2.4.2 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導入動物細胞，在宿主細胞中表達并合成抗原蛋白，激起抗體一系列類似于疫苗接種的免疫應答，起到預防和治療疾病的目的。具有易于制備、可塑性大、生產工藝簡單和成本低等優(yōu)點，并能使疫苗抗原在靶細胞內以天然的方式合成加工后遞呈給免疫系統，被譽為第三次疫苗的革命。

2.4.3 重組活載體疫苗

活載體疫苗是近年來研究熱點之一，制苗時將外源保護性目的基因插入活載體中，構成活載體基因工程疫苗或稱基因工程重組活疫苗。該種疫苗可誘導的免疫反應 （如：體液免疫、細胞免疫反應、粘膜免疫）比較廣泛，還具有成本低及安全性好等優(yōu)點，由于外源基因已經作為載體病毒自身結構的一部分，故所產生的免疫應答水平高于完整病毒相應成分所引起的免疫反應。

2.4.4 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是使病毒某一基因完全缺失或發(fā)生突變從而使其毒力減弱，感染宿主后誘發(fā)保護性免疫力反應。1997年Ballesteros等人[9]嘗試改變TGEV的S基因214、655位2個堿基，制成重組基因突變疫苗，進行呼吸道和腸道組織感染，結果表明只改變655位堿基，可對呼吸道TGEV產生特異性反應，只改變219位堿基卻能夠使TGEV腸嗜性發(fā)生缺失。

2.4.5 轉基因植物疫苗

轉基因植物疫苗是通過植物基因工程技術與機體免疫機理相結合，將免疫原性基因導入植物中，從而獲得有免疫原性蛋白表達的基因疫苗植株，將轉基因植物組織給動物飼喂，轉基因植物表達的抗原呈遞到動物的腸道淋巴組織，被其表面特異受體特別是M細胞所識別，產生粘膜免疫和體液免疫反應。2002年LamphearBJ等構建了表達S基因的轉基因玉米，用轉基因玉米種子飼喂豬發(fā)現，機體產生了保護性中和抗體，因此轉基因植物表達的TGEV S糖蛋白有經口免疫原性，并能激發(fā)機體較強的粘膜免疫反應，有望研究成可飼疫苗。

3 展望

TGEV分子生物學技術的發(fā)展和應用，使結構蛋白、核酸結構、基因表達方式及基因工程等方面的研究取得了較大的進展，同時也促進了其新型基因工程疫苗的研發(fā)速度。目前由于國內基因工程疫苗的研究起步較晚，還沒有高效的基因工程疫苗投入到生產中，但基因工程疫苗的優(yōu)勢無可爭議，今后TGEV疫苗的研究重點仍是基因工程疫苗特別是減毒活疫苗的研發(fā)。由于TGE的免疫以局部粘膜免疫為主，被動免疫特別是分泌型IgA在本病的預防中也發(fā)揮著重要作用，已經有利用抗體及其衍生物來防控TGE的報道[10,11]，RNA干擾技術也被成功用于TGEV防控的研究中[12]且效果顯著，口服疫苗也將是今后研發(fā)的方向之一。

[1]Sirinarumitr T,Siddell S,Grahare F,et al.Porcine transm issible gastroenteritis virus induced apoptosis in sw ine testes cell cultures[J].Archivesof Virology,1998,143（12）：2471-2485.

[2]Jones T,Shenk T.Transm issible gastroenteristis virus of pigs[J].Veterinary Record,1997,141（16）：427-428.

[3]W anger JE,Beamer PD and Ristic M.Electron M icroscopy of lntestinal Epithelial Cells of Piglets Infeeted w ith a Transm issible GastroenteritisVirus[J].Can JComp Med.1973,37：177-188.

[4]Conelius LM,Hooper BE,Haelterman E0.Changes in Fluid and Electrolyte Balance in Baby Pigsw ith Transm issible Gastroenteritis[J].Am J Clin Pathol.1968,2：105-113.

[5]Haelterman EO.On the control of transm issible gastroenteritisof sw ine[J].Proc.Annu.Meet.US.Anim.Health.Assoc,1973,（77）：345-349.

[6]Zhou J,Huang F,Hua X,et al.Inhibition of porcine transm issible gastroenteritisvirus（TGEV） replication in m ini-pigsby shRNA[J].Virus.Res,2010,149（1）：51-55.

[7]Schwegmann-W essels C,Herrler G.Sialic acids as receptor determ inants for corona viruses[J].Glycoconj.J,2006,23（1-2）：51-58.

[8]Aynaud JM,Bernard S,Bottreau E,et al.Induction of lactogenic immunity to transm issible gastroenteritisvirusof sw ine using an attenuated coronavirusmutant able to survive in the physicochemical environment of the digestive tract[J].Vet.M icrobiol,1991,26（3）：227-239.

[9]Rajc佗ni J,Mosko T,Rezuchov佗 I.Current developments in viral DNA vaccines：shall they solve the unsolved[J].Rev M ed Virol.2005.15（5）：303-25.

[10]Pulford DJand Britton P.Intracellular Processing of the Porcine Coronavirus Transm issible Gastroenteritis Virus Spike Protein Ex2 pressed by Recombinant Vaccinia Virus[J].Virology,1991,182（2）：765-773.

[11]Ballesteros M L,S佗nchez CM,Enjuanes L.Two am ino acid changes at the N-terminus of transm issible gastroenteritis coronavirus spike protein result in the loss of enteric tropism[J].Virology.1997.227（2）,378-388

[12]Penney CA,Thomas DR,Deen SS,W almsley AM.Plant-made vaccines in support of the M illennium Development Goals[J].PlantCell-Rep.2011,30（5）：789-98.Epub2011Jan18.