缺血性卒中體外模型建立

郭安臣，趙一龍，蘇芳，李巍巍，王擁軍，王群

缺血性卒中占全部卒中的60%～80%，是由于腦血液供應(yīng)障礙引起缺血、缺氧，營養(yǎng)剝奪，導(dǎo)致缺血中心的壞死和缺血周邊出現(xiàn)半暗帶區(qū)。即便恢復(fù)血液供應(yīng)，也會造成再灌注損傷，導(dǎo)致患者的病情繼續(xù)加重。針對腦缺血損傷的主要措施是積極采取腦保護(hù)措施?；谀X保護(hù)研發(fā)的藥物在臨床前實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出明顯的療效，而臨床試驗(yàn)卻無法獲得理想的結(jié)果，沒有一種腦保護(hù)藥物通過美國藥品食品管理局的批準(zhǔn)[1]。因此，從新的模型制作、新的藥物發(fā)現(xiàn)和保護(hù)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究對缺血性卒中的研究和臨床治療有更重要的意義。本文就腦缺血體外模型的現(xiàn)狀，制備方法進(jìn)行綜述希望對腦缺血的研究提供參考。

1 缺血性卒中體外模型

1.1 神經(jīng)元 神經(jīng)元一直被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞，神經(jīng)元的損傷、功能失調(diào)甚至凋亡將直接導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺失，因此既往很多治療腦血管病的神經(jīng)保護(hù)藥物都以保護(hù)神經(jīng)元為目標(biāo)，其中原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和神經(jīng)元細(xì)胞系相比更是受到研究人員的重點(diǎn)關(guān)注[2]。

神經(jīng)元損傷主要涉及下列機(jī)制：①興奮性氨基酸的毒性作用腦缺血缺氧時(shí)大量興奮性氨基酸，尤其是谷氨酸的暴發(fā)性釋放，N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體過度激活，形成所謂的“興奮毒性”，造成突觸后神經(jīng)元過度興奮、潰變、壞死[3]。②細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，發(fā)生缺血性卒中時(shí)，電壓依賴性Ca2+通道開放，引起損傷性Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞外大量Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞內(nèi)，此時(shí)的Na+流出細(xì)胞外，同時(shí)激活蛋白激酶C（protein kinase C）、磷脂酶C（phospholipase C）和磷脂酶D（phospholipase D）途徑，導(dǎo)致花生四烯酸堆積，對神經(jīng)元造成損傷[4]。③自由基生成增加。自由基是指最外層電子軌道上含有一個(gè)或多個(gè)未配對電子的物質(zhì)?？煞譃閮深悾阂活愂怯裳跽T發(fā)的自由基稱為氧自由基；另外一類是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物是脂自由基。氧自由基主要指O2-和-OH等，研究顯示，自由基損傷以缺血后再灌注時(shí)為最重，可能由于溪流和滴流的供血攜帶了微量氧進(jìn)入組織，為維持脂質(zhì)過氧化程序提供條件，加重自由基損傷[5]。④炎癥反應(yīng)。已經(jīng)證實(shí)，缺血損傷后產(chǎn)生組織炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)在炎癥因子上調(diào)，促黏附分子和黏附分子的表達(dá)增加。已知的致炎因子包括白細(xì)胞介素－1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素－6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；黏附分子包括細(xì)胞間黏附分子1、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素、血管細(xì)胞黏附分子等[6-7]。小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)在大鼠全腦缺血標(biāo)本也比較強(qiáng)烈，應(yīng)激的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β。動物實(shí)驗(yàn)顯示，大腦中腦動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠局灶缺血區(qū)20 min內(nèi)可見反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞，缺血再灌注損傷后缺血中心區(qū)內(nèi)充滿小膠質(zhì)細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)提出抗炎治療是神經(jīng)保護(hù)措施的理論依據(jù)[8]。⑤細(xì)胞凋亡不僅在發(fā)育過程中，而且在疾病發(fā)生中越來越受到人們的重視，它可能參與腫瘤、老年性癡呆等神經(jīng)退變性疾病、艾滋病等疾病發(fā)生[9]。以前的研究認(rèn)為，腦缺血過程中的細(xì)胞死亡是一種被動的壞死，然而最近的研究提示，缺血缺氧可能誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺血性損害的急性期及遲發(fā)性神經(jīng)無損害期，凋亡細(xì)胞均存在，而在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期以細(xì)胞凋亡為主。缺血性損害的急性期，凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞并存，提示神經(jīng)細(xì)胞凋亡與壞死均參與腦缺血急性期細(xì)胞損害，但各自程度與缺血損害的輕重有關(guān)。輕度缺血時(shí)壞死表現(xiàn)輕微，細(xì)胞凋亡成為細(xì)胞損害的主要形式。在遲發(fā)性神經(jīng)元損害期，無論是輕度缺血還是重度缺血，細(xì)胞凋亡均是細(xì)胞丟失的主要形式。

1.2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 大腦由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，生物的進(jìn)化程度越高，膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)細(xì)胞中所占的比例也越高，人腦內(nèi)90%的細(xì)胞皆為膠質(zhì)細(xì)胞。最新研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中的發(fā)病及治療過程中發(fā)揮重要作用，成為治療缺血性卒中的新靶點(diǎn)[11]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)促紅細(xì)胞生成素的主要來源，促紅細(xì)胞生成素能夠減少神經(jīng)元的凋亡，降低興奮性氨基酸毒性及一氧化氮（nitric oxide，NO）引起的細(xì)胞死亡。同時(shí)卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)血管樣表皮生長因子，這種血管樣表皮生長因子有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠抑制遲發(fā)性細(xì)胞凋亡；且能夠促進(jìn)血管的再生，對缺血性卒中的康復(fù)有重要意義[12-14]。細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)表明，移植到腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠高表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factors）、血小板源性生長因子（plateletderived growth factors）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein）等，而星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過這些細(xì)胞因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。

1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞與血腦屏障 缺血性卒中除神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生病理生理性改變外，向大腦供血的血管壁的完整性也遭到破壞。血管壁由血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜構(gòu)成，正常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放活性因子，調(diào)節(jié)血管張力、凝血、纖溶功能及維持正常血壓均有一定的作用，一旦血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜受到損傷，可使血小板黏附、聚集，導(dǎo)致血栓形成，而且受刺激的內(nèi)皮細(xì)胞可釋放促凝血因子參與外源性凝血過程，加速血栓形成[16-17]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞一起形成血腦屏障，血腦屏障能夠阻止損傷因子進(jìn)入腦組織，同時(shí)也阻止了神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)入腦組織發(fā)揮作用的可能性[18]。血管內(nèi)皮損傷和缺血性卒中密切相關(guān)，目前對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的確切機(jī)制及防治方法尚未完全清晰，因此，進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制對治療缺血性卒中有重要意義。

1.4 腦片模型 細(xì)胞培養(yǎng)雖然具備實(shí)驗(yàn)條件易于控制，方便操作，細(xì)胞的生物學(xué)特征明確，但是，由于脫離了體內(nèi)環(huán)境，使其喪失了組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞之間的聯(lián)系以及與之相關(guān)的生化特性。為了更好地研究缺血性卒中后各種細(xì)胞的變化，探索缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的治療方法。有學(xué)者建立了腦片模型，它相對于原代腦內(nèi)的各種細(xì)胞，腦片可在體外培養(yǎng)數(shù)周時(shí)間，能保留體內(nèi)狀態(tài)下的細(xì)胞構(gòu)成，突觸回路，受體分布，細(xì)胞間的相互作用和三維立體結(jié)構(gòu)，具有正常和完整的突觸通路、遞質(zhì)傳遞和電生理等功能；腦片培養(yǎng)排除了體內(nèi)模型中血腦屏障（bloodbrain barrier）的干擾，可采用人工培養(yǎng)基或添加各種藥物，易于控制培養(yǎng)環(huán)境[19]。

1.5 神經(jīng)血管單元 盡管國內(nèi)外研究者圍繞缺血后神經(jīng)元的損傷與修復(fù)機(jī)制進(jìn)行了大量的研究并取得一定進(jìn)展，但仍缺乏有效治療方法。過去對腦缺血損傷研究大多局限在神經(jīng)元本身，或者將大腦中不同的細(xì)胞群體和結(jié)構(gòu)分割開來研究，忽略了大腦功能的整體性和不同結(jié)構(gòu)間的相互作用。2003年，美國科學(xué)家Lo等提出腦神經(jīng)血管單元的概念。神經(jīng)血管單元這一概念的提出，為臨床治療缺血性卒中提供了新的靶點(diǎn)?！澳X神經(jīng)血管單元”是由微血管（這些血管的內(nèi)皮-基質(zhì)-星形細(xì)胞足突復(fù)合體是一個(gè)完整的部分）、血管周圍的星形細(xì)胞突起及由這些突起所支持的神經(jīng)元及軸突共同組成的復(fù)合體，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞、基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)[20]。

2 模型制備與干預(yù)方法

缺血性卒中體外模型制備主要涉及細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)?，F(xiàn)對常用細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法做簡要介紹。

2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 經(jīng)典原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法 多采用15～18 d孕齡的胎鼠或新生鼠，在無菌條件下取材、機(jī)械分離、酶消化等步驟獲得細(xì)胞懸液，接種至包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿內(nèi)，用添加B27的Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，可獲得純度較高的原代培養(yǎng)神經(jīng)元，培養(yǎng)7～10 d后用于實(shí)驗(yàn)[12]。

2.1.2 經(jīng)典原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法 經(jīng)典原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法是由McCarthy 和Vellis于1980年建立的。膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的取材過程與神經(jīng)元原代培養(yǎng)類同，只是培養(yǎng)時(shí)換成利于膠質(zhì)細(xì)胞生長的杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），體外培養(yǎng)l0～12 d后細(xì)胞融合并分層：上層主要為小膠質(zhì)細(xì)胞，下層主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞。通過不同時(shí)間的水平搖動，使得小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞得以純化，并應(yīng)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)[22]。2.1.3 原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 一般從成年動物大腦皮質(zhì)取材，剪刀破碎成1 mm大小，膠原酶消化后，經(jīng)密度梯度離心或過篩方法獲得，然后接種至Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)4～5 d后融合形成緊密連接的單層細(xì)胞[23]。

而建立體外血腦屏障模型，則需要同時(shí)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，將兩種細(xì)胞分別培養(yǎng)在Transwell細(xì)胞小室的上下層，通過測試通透性和跨內(nèi)皮電阻（transendothelial electrical resistance，TEER）判斷血腦屏障模型的完成情況。進(jìn)一步利用血腦屏障模型進(jìn)行藥物及其他試驗(yàn)[24]。

2.1.4 腦片制備 腦片制備多采用出生后6～8 d的乳鼠。低溫麻醉后，用75%的乙醇浸泡消毒，斷頭取腦，迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的人工腦脊液中，用振動切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為200～400 μm。整個(gè)過程要無菌。腦片穩(wěn)定過夜后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[25]。

2.1.5 神經(jīng)血管單元制作方法 神經(jīng)血管單元制作以Transwell培養(yǎng)小室為媒介，結(jié)合原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在一個(gè)體系中，同一體系的三種細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，從形態(tài)學(xué)、屏障特性、特征性蛋白表達(dá)水平及niche環(huán)境的變化對神經(jīng)血管屏障進(jìn)行研究[26]。

2.2 制備缺血性卒中體外模型的干預(yù)方法 缺血性卒中的主要病因是由于血栓阻塞血管造成缺血缺氧區(qū)域的細(xì)胞發(fā)生病變，因此有關(guān)制備缺血性卒中模型的干預(yù)方法適用于所有細(xì)胞模型。

2.2.1 缺血、缺氧 氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）是使用低氧裝置結(jié)合無糖、無血清培養(yǎng)基或是向無糖培養(yǎng)基中持續(xù)通入不含氧的混合氣體（5%CO2+95%N2）來模擬缺糖、缺氧環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)缺血、缺氧處理一段時(shí)間后，再把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常氧濃度和含糖培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)，以模擬細(xì)胞或組織缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)過程。

2.2.2 興奮毒性 一般采用谷氨酸或谷氨酸鹽和NMD，NMDA等試劑。100 μmol/L的谷氨酸鹽作用于皮質(zhì)神經(jīng)元5 min即可造成大量損傷。在損傷的基礎(chǔ)上研究神經(jīng)元損傷的機(jī)制，或者探索減輕損傷的方法。

2.2.3 自由基過度形成 自由基過度形成主要采用過氧化氫、叔丁基過氧化氫、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）等模擬腦缺血和缺血再灌注產(chǎn)生的活性氧（超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等）所引起的氧化應(yīng)激損傷。模擬腦缺血時(shí)自由基過度形成的微環(huán)境，從而進(jìn)行抗自由基或神經(jīng)保護(hù)研究。

2.2.4 炎癥因子 對于體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞或腦組織，可給予脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而產(chǎn)生多種炎癥效應(yīng)：TNF-α等炎癥因子的釋放，激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶合成NO，下調(diào)谷胱甘肽的表達(dá)等，對揭示缺血性腦卒中的免疫機(jī)制有重要意義。

2.2.5 細(xì)胞內(nèi)鈣超載 鈣離子具有重要的功能，靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為100 nmol/L，比細(xì)胞外鈣離子濃度低2萬倍，這種跨膜濃度梯度差由多種機(jī)制維持，包括細(xì)胞膜對鈣離子通透性的限制、主動排鈣機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)鈣潴留等。各種損傷因素導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常增加，可比正常時(shí)高出100～200倍，稱為鈣超載。鈣超載后細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)功能障礙，激活鈣依賴性磷脂酶，釋放對細(xì)胞有毒性的物質(zhì)；升高鈣調(diào)蛋白酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流動，引起細(xì)胞死亡。細(xì)胞鈣超載模型可用咖啡因、氯化鉀、NMDA等誘導(dǎo)。

目前在抗腦缺血的機(jī)制及藥物篩選研究中，雖然整體動物模型比較接近于腦缺血病理狀態(tài)，但是由于實(shí)驗(yàn)動物的個(gè)體差異較大，實(shí)驗(yàn)人員在制備動物模型時(shí)的技術(shù)水平不同，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易造成影響。而且動物模型的制備有一定難度，損傷的均一性難以掌握，工作量大，周期長，花費(fèi)高。而利用細(xì)胞模型則可以克服動物模型的不足。而且可以根據(jù)腦缺血病理生理機(jī)制中的不同進(jìn)程，有選擇地從不同角度選用不同類型的細(xì)胞模型，對于研究缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制及大規(guī)模篩選藥物有重要的意義。

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【點(diǎn)睛】

缺血性卒中體外模型對于研究發(fā)病機(jī)制，篩選神經(jīng)保護(hù)藥物，探討治療方案具有重要意義。