嚙齒類(lèi)血管性癡呆動(dòng)物模型

王群，王擁軍

由腦血管因素引起腦組織血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致的腦功能衰退，表現(xiàn)為認(rèn)知功能缺損，統(tǒng)稱(chēng)為血管性癡呆（vascular dementia，VD）[1]，亦稱(chēng)血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）[2]。VD不是一個(gè)單一的疾病，而是一類(lèi)綜合征，大、小動(dòng)脈病變，彌漫性缺血性白質(zhì)病變，心臟脫落栓子的栓塞，血流動(dòng)力學(xué)改變，出血，血液學(xué)因素和遺傳性疾病等不同的血管病理變化均可引起VD癥狀。流行病學(xué)研究顯示在歐洲和北美，VD是繼老年性癡呆（Alzheimer’s disease，AD）之后引起老年期癡呆（60%～70%）的第二病因，在所有癡呆中占15%～20%。隨著人口老齡化的進(jìn)展及腦血管病發(fā)病率的增加，VD有可能成為癡呆的第一病因[3]。由于VD被認(rèn)為是唯一可以治療的癡呆類(lèi)型，但其發(fā)病的確切病理生理機(jī)制尚不明了，建立可靠的VD動(dòng)物模型是研究VD發(fā)病機(jī)制、干預(yù)治療、藥物篩選及評(píng)價(jià)的關(guān)鍵，具有積極的臨床意義[4]。

腦部反復(fù)缺血再灌注和長(zhǎng)期慢性低灌注是VD的主要原因[5-6]。臨床上雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和單側(cè)椎動(dòng)脈閉塞的患者表現(xiàn)有亞急性的行為異常、認(rèn)知缺陷和額葉腦血流減低，顱內(nèi)-顱外血管旁路移植術(shù)后腦血流和認(rèn)知功能明顯改善，支持腦低灌注引起VD的概念[7]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，慢性腦低灌注導(dǎo)致癡呆樣認(rèn)知損害，大腦海馬神經(jīng)元損傷，額葉皮層下白質(zhì)損傷，腦淀粉樣蛋白沉積，小血管病變或微循環(huán)障礙和突觸可塑性改變可能是血管性癡呆的病理基礎(chǔ)。因此，動(dòng)物反復(fù)腦缺血再灌注引起大腦慢性低灌注是制作VD較理想的動(dòng)物模型[5-6]。

理想的VD動(dòng)物模型應(yīng)符合以下要求：①病理機(jī)制與人類(lèi)相似；②動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)；③明顯的中樞神經(jīng)元損傷；④行為學(xué)指標(biāo)異常并易于進(jìn)行認(rèn)知功能的評(píng)價(jià)；⑤動(dòng)物來(lái)源方便；⑥造模方法具有可行性。一個(gè)理想的動(dòng)物模型應(yīng)該能夠滿足上述幾點(diǎn)要素。但目前尚無(wú)一種模型能達(dá)此要求。在VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面，非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)是最好的模型，因其腦內(nèi)血管結(jié)構(gòu)、走向，充足的腦回和廣泛的白質(zhì)與人類(lèi)最為接近[5]。然而，大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)選用嚙齒類(lèi)小型動(dòng)物如大鼠、小鼠或沙鼠，原因是價(jià)格較低和容易被倫理組織接受。沙鼠和某些種系小鼠因?yàn)槿狈蠼煌▌?dòng)脈及完整的基底動(dòng)脈環(huán)，兩側(cè)大腦供血相對(duì)獨(dú)立，通過(guò)閉塞側(cè)或雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）即可復(fù)制效果明顯的全腦缺血模型，但因?yàn)轶w型小，難以監(jiān)測(cè)各種生理和復(fù)雜的行為學(xué)指標(biāo)，應(yīng)用亦不太廣泛。目前，VD模型主要以大鼠為主，大鼠的腦血管分布與人類(lèi)酷似，均由頸動(dòng)脈系及椎基底動(dòng)脈系在腦底吻合成動(dòng)脈環(huán)，通過(guò)分支共同完成腦供血；同時(shí)，大鼠經(jīng)濟(jì)易得、易存活，便于進(jìn)行動(dòng)物智能測(cè)試及電生理檢查。因而大鼠是建立VD模型最適合的動(dòng)物。

目前大鼠VD動(dòng)物模型眾多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，理想的VD模型要求動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)且有明顯的中樞神經(jīng)元損傷及公認(rèn)的行為學(xué)指標(biāo)異常。制作方法可參考缺血性卒中模型制作部分，根據(jù)制作方法不同歸納為以下4種類(lèi)型：血管阻斷VD模型（vessel occlusion VD model）、血管內(nèi)栓塞VD模型（多發(fā)性腦梗死VD模型）、光化學(xué)誘導(dǎo)VD模型、自發(fā)性VD模型。

1 血管阻斷VD模型

1.1 四血管阻斷法 目前國(guó)際公認(rèn)的VD造模方法之一為改良的Pulsinelli四血管阻斷全腦缺血法[8-9]：通常是先用電凝針阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈造成永久性閉塞，然后分離雙側(cè)CCA，穿結(jié)備用。24 h后用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA 5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h，最終制備成全腦反復(fù)缺血再灌注模型。該模型的優(yōu)點(diǎn)為：制作過(guò)程與VD的發(fā)病機(jī)制（反復(fù)腦缺血）相接近；病理改變較為充分、明確，海馬損傷明顯；可顯示學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的減退；缺血后生理指標(biāo)穩(wěn)定，無(wú)明顯的肢體運(yùn)動(dòng)障礙。但是手術(shù)復(fù)雜，制作有一定的難度，并且由于雙側(cè)椎動(dòng)脈的灼閉使腦干的血液供應(yīng)受到了很大的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生命中樞受到了抑制，動(dòng)物的死亡率相對(duì)較高。

1.2 三血管阻斷法 Kameyama等[10]首先報(bào)道了三血管阻斷腦缺血再灌注模型。先用電凝切斷大鼠基底動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)CCA，通過(guò)阻斷與開(kāi)放雙側(cè)CCA，實(shí)現(xiàn)全腦缺血再灌注模型的制備。優(yōu)點(diǎn)是：缺血較為迅速，缺血效果好，再灌注血流恢復(fù)迅速，比較適用于急性全腦缺血性疾病損傷的研究；模型穩(wěn)定性好，可通過(guò)阻斷CCA的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)控制缺血程度，模型成功率高。但是需要開(kāi)顱，暴露基底動(dòng)脈，手術(shù)創(chuàng)傷大，在手術(shù)中對(duì)周?chē)M織、神經(jīng)牽拉較嚴(yán)重；在暴露及夾閉基底動(dòng)脈時(shí)，易損延髓，操作不當(dāng)易造成動(dòng)物死亡。

1.3 兩血管阻斷法 雙側(cè)CCA永久性結(jié)扎的腦缺血模型比較簡(jiǎn)單[6，11-12]，即分離雙側(cè)CCA，用線將其永久性結(jié)扎，縫合傷口。該模型是一種慢性低灌注模型，可導(dǎo)致腦組織的漸進(jìn)性損害[11]，使學(xué)習(xí)記憶損害程序性加重，能較好地模擬人類(lèi)腦血管病和癡呆狀態(tài)，且在結(jié)扎術(shù)后2～3個(gè)月學(xué)習(xí)記憶能力仍無(wú)恢復(fù)趨勢(shì)，這有利于藥物療效的動(dòng)態(tài)觀察[5]。優(yōu)點(diǎn)是：手術(shù)簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、重復(fù)性好、死亡率低，是研究人類(lèi)癡呆的病理生理學(xué)和治療藥物的一個(gè)較好的模型。但是提供的是全腦不完全性缺血模型（慢性低灌注），對(duì)腦外的其他臟器也有影響，與人類(lèi)腦梗死通常由單一腦動(dòng)脈閉塞所導(dǎo)致的情形不同。

單純結(jié)扎大鼠雙側(cè)CCA，由于大腦動(dòng)脈環(huán)的代償作用，側(cè)支循環(huán)的建立，難以達(dá)到理想的全腦缺血狀態(tài)，從而影響模型的可靠性。而復(fù)合模型的出現(xiàn)較好地解決了這些問(wèn)題：①兩動(dòng)脈阻斷與尾端放血法。分離雙側(cè)CCA并結(jié)扎，2次短時(shí)阻斷血流，同時(shí)從尾尖部放血（不超過(guò)每100 g體重1 ml），然后使血流復(fù)通。②兩動(dòng)脈阻斷與高脂血癥。首先將實(shí)驗(yàn)大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月，待血脂升高后再用兩動(dòng)脈阻斷法。缺血時(shí)阻斷雙側(cè)CCA 3次，每次10 min，每次間隔10 min，通過(guò)阻斷與開(kāi)放雙側(cè)CCA，實(shí)現(xiàn)全腦缺血再灌流模型。③兩動(dòng)脈阻斷與硝普鈉降血壓法。分離雙側(cè)CCA，穿線備用，腹腔注射硝普鈉（205 mg/kg）造成低血壓，立即夾閉雙側(cè)CCA 10 min，再通10 min，如此反復(fù)3次。

1.4 大腦中動(dòng)脈栓塞 目前制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型的代表方法是Koizumi[13]和Longa[14]法。采用頸部正中切口，分離出CCA、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），將硅膠或多聚賴(lài)氨酸包被好的尼龍線由ECA（Longa方法）或CCA（Koizumi方法）經(jīng)ICA小心插入顱內(nèi)并越過(guò)大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA），到達(dá)大腦前動(dòng)脈起始部，阻斷MCA血液供應(yīng)制成MCA栓塞動(dòng)物模型。這種模型缺血部位恒定，且可進(jìn)行再灌注，模擬了人類(lèi)永久性及短暫性局灶性腦缺血的不同狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：缺血灶明確、可重復(fù)性強(qiáng)；模型動(dòng)物存在明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙[15]。但手術(shù)操作需要技巧；腦栓塞與人群常見(jiàn)的腦梗死存在一定差異。

2 多發(fā)性腦梗死VD模型

采用頸動(dòng)脈注射微小栓子方法制作多發(fā)性腦梗死VD（multiple cerebral infarct VD model）模型。參考Kaneko等[16]的方法加以改進(jìn)，在生理鹽水中加入同種大鼠血凝塊制成的混懸液，從實(shí)驗(yàn)大鼠CCA推注栓子鹽水混懸液，在注入栓子的同時(shí)開(kāi)放CCA，利用CCA的血液栓子通過(guò)ICA送入顱內(nèi)至鼠腦各動(dòng)脈，造成多灶性腦梗死。已有研究顯示多發(fā)性腦梗死模型動(dòng)物具有明顯的學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙[17]。

許多化合物和人工栓子材料曾經(jīng)被注射入大鼠CCA或ICA誘導(dǎo)腦栓塞缺血模型。其中，微球誘導(dǎo)的微栓塞研究得最為廣泛[18-19]。微球注射導(dǎo)致持續(xù)性腦血流量減低[20]，誘導(dǎo)的缺血損傷的程度及嚴(yán)重性與栓子的數(shù)量相關(guān)，且病灶的發(fā)展緩慢，注射24 h后病灶仍在增加[18]。另外一個(gè)特征是病灶發(fā)展的多灶性及不均勻性[21]。

該模型的優(yōu)點(diǎn)是：多灶和不均勻性使得該模型類(lèi)似于臨床上多發(fā)性腦梗死或腔隙性卒中[22]；缺血病灶的緩慢發(fā)展導(dǎo)致一個(gè)較長(zhǎng)的治療時(shí)間窗。缺點(diǎn)是：由于栓子的隨機(jī)性，無(wú)法預(yù)測(cè)梗死的部位和大小，側(cè)支循環(huán)的影響使組織缺血程度不一，不利于神經(jīng)癥狀觀察和組織定量分析；微球栓塞法中的栓子不能很好地模擬人類(lèi)腦栓塞的栓子性質(zhì)，該模型誘導(dǎo)的病灶不能準(zhǔn)確地模擬臨床狀況，從而限制了它的應(yīng)用，研究工作有待進(jìn)一步的拓展。

此外，國(guó)內(nèi)還有其他血管內(nèi)栓塞VD造模方法，如左心室注射液體石蠟?zāi)Ｐ?，舌下靜脈注入鐵粉模型線栓法等。

3 光誘導(dǎo)血栓形成VD模型

光化學(xué)法的基本原理是在全身注射光敏劑后，采用特定波長(zhǎng)光源照射大腦皮層局部，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致局部血管內(nèi)皮損傷、產(chǎn)生腦水腫和血小板微血栓，形成局灶性腦梗死。通過(guò)選擇照射區(qū)域而確定皮層梗死灶位置。由于該模型具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷小，模型穩(wěn)定性好且易于復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)得到了比較廣泛的應(yīng)用。動(dòng)物存活率高，存活時(shí)間長(zhǎng)，學(xué)習(xí)記憶障礙明顯[23-24]。無(wú)論是從光化學(xué)法模型的原理，還是VD的發(fā)病原因和過(guò)程而言，該模型都適用于VD模型的制作。

該模型的優(yōu)點(diǎn)是[25]：通過(guò)控制光源的強(qiáng)度、時(shí)間和藥物用量來(lái)控制腦梗死的部位、范圍和深度；無(wú)須開(kāi)顱，動(dòng)物模型的成功率高，存活時(shí)間長(zhǎng)，適于慢性腦缺血低灌注導(dǎo)致的認(rèn)知及行為學(xué)研究和抗血小板聚集、血栓形成及功能恢復(fù)藥物篩選。缺點(diǎn)是：不能實(shí)施完全的再灌注；該方法本質(zhì)上是終末動(dòng)脈的血栓形成易引起明顯的微血管損傷，造成動(dòng)脈閉塞；內(nèi)皮細(xì)胞損害、血腦屏障破壞、血管源性腦水腫均與人類(lèi)的病理變化不同；光敏物質(zhì)的導(dǎo)入對(duì)研究全身血液循環(huán)系統(tǒng)的變化摻入了復(fù)雜因素。

4 自發(fā)性VD模型

自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）和自發(fā)性高血壓卒中傾向大鼠（SHR-stroke-prone，SHRSP）被認(rèn)為是最好的原發(fā)性高血壓和卒中動(dòng)物模型[26-27]。大多數(shù)SHRSP模型動(dòng)物在穿通支動(dòng)脈處出現(xiàn)動(dòng)脈缺血性壞死和形成微小動(dòng)脈瘤，并由此形成多發(fā)性腦梗死，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)這些動(dòng)物有腦梗死灶存在，行為學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。神經(jīng)生化研究顯示SHRSP動(dòng)物的海馬和大腦皮層乙酰膽堿濃度顯著性降低，其行為異常與海馬乙酰膽堿含量水平明顯相關(guān)[28]，提示存在膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)損害，支持VD的生化和病理變化。最近，在6個(gè)月SHR的大腦皮層亦發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡和壞死及膠質(zhì)細(xì)胞增生，提示SHR具有增加VD的危險(xiǎn)因素。因此，從老齡SHR和SHRSP中可以篩選出遺傳易感性的VD模型動(dòng)物[26，29]。但顯而易見(jiàn)，使用該方法制備VD模型，大鼠來(lái)源有限，價(jià)格相應(yīng)較昂貴，不適宜開(kāi)展大規(guī)模的研究。另外，自發(fā)性VD大鼠的發(fā)病與臨床VD患者在多危險(xiǎn)因素共同作用下發(fā)病的情況有所不同，值得注意。

5 觀察指標(biāo)

5.1 行為學(xué)觀察 大腦海馬神經(jīng)元和額葉皮層下白質(zhì)損傷可能是VD的病理基礎(chǔ)。學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級(jí)認(rèn)知功能，是構(gòu)成智能的要素。各種VD動(dòng)物模型最終的行為學(xué)表現(xiàn)均為學(xué)習(xí)和記憶功能受損，故常把學(xué)習(xí)記憶的改善作為評(píng)價(jià)VD模型智能提高的指標(biāo)。常用的觀察嚙齒類(lèi)動(dòng)物認(rèn)知行為的方法有[5，30]：一次性被動(dòng)回避反射實(shí)驗(yàn)如跳臺(tái)法、避暗法、穿梭箱法；空間分辨學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)如Y形水迷宮實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、操作式條件反射等。

5.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 作為參與學(xué)習(xí)和記憶功能的重要結(jié)構(gòu)，海馬是對(duì)缺血、缺氧損傷最為敏感的區(qū)域，前腦反復(fù)缺血再灌注及慢性腦低灌注造成海馬結(jié)構(gòu)損傷可能是學(xué)習(xí)和記憶受損的原因[5，31-32]。海馬是腦內(nèi)參與學(xué)習(xí)記憶、記憶貯存功能的重要部分，因此研究中多以皮質(zhì)及海馬CA區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞的變性損傷及膠質(zhì)細(xì)胞增生變化作為觀察指標(biāo)。

5.3 神經(jīng)生化指標(biāo)觀察 越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)表明，膽堿能系統(tǒng)的損害參與了VD的形成，包括腦脊液乙酰膽堿含量減少、腦中降低的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性[33]。海馬膽堿能神經(jīng)元的損傷可能是認(rèn)知功能受損害的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[15，28，34]。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志，其分布與乙酰膽堿的分布幾乎平行，故?？勺鳛檠芯磕憠A能神經(jīng)的標(biāo)志[35]。

綜上所述，近年對(duì)VD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型方法的研究和探討取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但仍存在著許多問(wèn)題。缺血性腦血管病是VD的主要原因，因此既往許多學(xué)者曾采用各種腦缺血模型進(jìn)行VD的機(jī)制研究。而慢性腦缺血對(duì)認(rèn)知過(guò)程影響的研究對(duì)闡明VD的病理過(guò)程是十分重要與必要的。然而，VD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能喪失是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，腦血管病和癡呆的關(guān)系仍是未解之謎。模擬人類(lèi)缺血性腦血管病的發(fā)病過(guò)程，建立重復(fù)性好、生理指標(biāo)控制嚴(yán)格、利于病理指標(biāo)觀察的標(biāo)準(zhǔn)化VD動(dòng)物模型，是研究VD發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治措施，療效評(píng)價(jià)的關(guān)鍵[4]。相信隨著神經(jīng)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及科研水平的不斷提高，VD動(dòng)物模型的制作將會(huì)取得更深層次的突破，必將對(duì)VD的臨床及實(shí)驗(yàn)研究起到更大的推動(dòng)作用。

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