曲古抑菌素A在腫瘤免疫治療中的作用及機制

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.006

基金項目：國家自然科學(xué)基金海外及港澳學(xué)者合作研究基金（31428005）；國家自然科學(xué)基金（81171653、30950022）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011246）；江蘇省條件建設(shè)與民生科技專項資金（BL2014034）

作者單位：213003 常州，蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心

通信作者：蔣敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

收稿日期：2015-06-08

表觀遺傳學(xué)（epigenetic）修飾是基因表達(dá)調(diào)控的重要形式之一，即在不改變特定基因核苷酸序列的情況下，通過DNA 的乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化的共價修飾作用使基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的變化，從而改變細(xì)胞功能 [1]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）是基于表觀遺傳學(xué)理論發(fā)現(xiàn)的一類新型抗腫瘤藥物，因其廣譜、高效、低毒，抗腫瘤效果良好，具有較好的應(yīng)用前景。曲古抑菌素 A（trichostatin A，TSA）來源于鏈霉菌代謝產(chǎn)物，是最早被應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療的 HDACi 家族成員之一。TSA 以組蛋白去乙?；福℉DAC）為靶點，通過抑制 HDAC 的活性，有效上調(diào)細(xì)胞中組蛋白乙?；?，促進(jìn)細(xì)胞分化，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)抗腫瘤轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，調(diào)控相關(guān)信號通路，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng) [2]。

腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）是繼手術(shù)、化療、放療后第四種腫瘤綜合治療手段，因其能改善患者腫瘤微環(huán)境，提高機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，且毒副作用小，與手術(shù)等其他治療手段協(xié)同效果好，受到越來越多的關(guān)注 [3]。有學(xué)者認(rèn)為，未來大部分腫瘤患者將主要接受免疫治療 [4]。盡管腫瘤免疫治療應(yīng)用前景廣闊，但由腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞（如 Treg、MDSCs）及免疫抑制因子（如 TGF-β、PD-L1、FasL）等引起的腫瘤免疫耐受是腫瘤免疫治療失敗的常見原因。因此，腫瘤的綜合治療模式仍是目前腫瘤治療的主要研究方向。TSA 以往主要應(yīng)用于抗腫瘤的基礎(chǔ)研究及臨床藥物試驗，近期研究表明，TSA 在多項腫瘤聯(lián)合免疫治療中均顯示出較強的協(xié)同及增強作用，為腫瘤免疫治療提供了新的思路?，F(xiàn)就 TSA 在腫瘤免疫治療中的作用及機制綜述如下。

1　生物學(xué)特點與功能

組蛋白乙?；墙M蛋白共價修飾的形式之一。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）通過改變核小體結(jié)構(gòu)，使組蛋白染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，進(jìn)而開啟基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá) [5]。HDAC 作用則正好相反，在其影響下組蛋白賴氨酸殘基上的乙酰基被移去，使染色質(zhì)與組蛋白結(jié)合得更緊密，引起基因轉(zhuǎn)錄抑制 [6]。兩者共同維持乙?；Ｋ?。

TSA 是一種強效、特異并且可逆的 HDAC 抑制劑，為氧肟酸鹽類化合物，是第一個被發(fā)現(xiàn)能抑制 HDAC 的天然氧肟酸，可作用于第 I、II 類 HDAC。TSA 主要通過其氧肟酸基團與底物競爭性結(jié)合 HDAC 上的鋅離子，使HDAC 失活，從而發(fā)揮抑制作用。研究證實，TSA 可持續(xù)誘導(dǎo) p21 基因表達(dá)上調(diào)，這與該基因啟動子 HDAC 和c-myc 結(jié)合減少有關(guān) [7]。TSA 在提高多種抑癌轉(zhuǎn)錄因子乙酰化水平的同時，也能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡。

2　抗腫瘤作用機制

2.1 阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

TSA 通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶（CDK）抑制劑 p21、p27 的表達(dá)以及下調(diào)細(xì)胞周期蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin D2 的含量，抑制 CDK 的活化，從而使腫瘤細(xì)胞停滯在 G1 或 G2 期，阻滯腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長 [8]。Alao 等 [9]研究表明，TSA 可以在 MCF-7 系乳腺癌細(xì)胞中迅速降解cyclin D1，使乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于 G0/G1 期。Noh 等 [10]報道，TSA 作用于 HeLa 細(xì)胞時可以降低 cyclin B1、PLKl 和 survivin 蛋白表達(dá)水平，同時上調(diào) p21 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于 G2/M 期。

TSA 主要通過外源性及內(nèi)源性兩條途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。外源性途徑主要通過上調(diào)多種死亡受體，如 TRAIL、FasL、TNF 等，激活腫瘤細(xì)胞與相應(yīng)配體的結(jié)合，誘導(dǎo)caspase-3 及 caspase-8 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑通過釋放線粒體間膜蛋白顯著降低線粒體間膜電位，從而激活 caspase 途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Taghiyev 等 [11]研究發(fā)現(xiàn)，TSA 通過激活 caspase-9 途徑，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素 C 和線粒體間膜蛋白，通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，研究者預(yù)先阻斷 caspase-9 激活途徑，導(dǎo)致細(xì)胞抵抗 TSA 誘導(dǎo)的凋亡，表明線粒體途徑在 TSA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用。

2.2 抑制腫瘤血管生成

腫瘤的生成大多與微環(huán)境缺氧有關(guān)。在缺氧的情況下，由于 HDAC 過度表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因 p53 和 VHL 轉(zhuǎn)錄受阻，引起缺氧誘導(dǎo)因子 HIF-1α 和血管內(nèi)皮生長因子 VEGF過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成 [12]。研究表明，TSA 主要通過下調(diào)因缺氧而導(dǎo)致的腫瘤血管生成相關(guān)基因的表達(dá)以及直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而抑制腫瘤血管生成 [13]。Yang 等 [13]發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤中，TSA 通過抑制 HIF-1α 及 VEGF 的表達(dá)，誘導(dǎo)其受體降解，并通過上調(diào) p53 和VHL 的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤血管生成。同時，TSA 亦能上調(diào) VEGF 抵抗劑 sema-phorin 3 的表達(dá)。

2.3 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化

TSA 能在不殺傷腫瘤細(xì)胞的情況下，誘導(dǎo)去分化腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞方向分化。目前研究表明，TSA 對包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化的能力。Uchida 等 [14]證實，TSA 可通過誘導(dǎo)階段特異性蛋白 glycodelin 的表達(dá)，促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的分化。Rahman 等 [15]用 TSA 作用于髓系白血病細(xì)胞株 RAW264，發(fā)現(xiàn) TSA 促進(jìn)細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化而不向破骨細(xì)胞分化。

3　在腫瘤免疫治療中的作用

TSA 不僅對腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用，更在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)抗腫瘤免疫療效。時玉舫團隊揭示了 TSA 通過抑制腫瘤浸潤 T 細(xì)胞凋亡，提高抗腫瘤免疫效應(yīng)，能有效抑制腫瘤生長 [16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TSA 通過抑制 Fas-FasL 通路介導(dǎo)的免疫細(xì)胞“激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（activation-induced cell death，AICD）”過程減少細(xì)胞死亡，從而抑制下游凋亡信號的激活。同時，他們團隊還發(fā)現(xiàn) TSA 和 CTLA4 單抗的聯(lián)合應(yīng)用可極大地促進(jìn) CD4 +T 細(xì)胞的浸潤，發(fā)揮抗腫瘤免疫治療的協(xié)同作用 [16]。

3.1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞被免疫細(xì)胞識別

對腫瘤細(xì)胞的識別和清除主要由腫瘤特異性 T 細(xì)胞執(zhí)行，除此之外，還依賴于腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）以及 MHC I 類分子的表達(dá)水平。TSA 可以通過上調(diào) MHC I 類分子、共刺激分子以及黏附分子的表達(dá)水平提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，導(dǎo)致 IFN-γ 分泌 T 細(xì)胞的活化 [17]并增強 CTL 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力 [18]。在小鼠漿細(xì)胞瘤研究中還證實，TSA 通過激活 pIII-CIITA 啟動子誘導(dǎo) MHC II 類分子的表達(dá)，導(dǎo)致 CD4 +T 細(xì)胞的擴增 [19]。此外，TSA 能夠在抗原肽缺陷小鼠的細(xì)胞系中增加或誘導(dǎo)抗原肽轉(zhuǎn)運基因TAP-1、TAP-2 以及 LMP-2 的表達(dá) [20]。NK 細(xì)胞通過活化受體 NKG2D 與其配體 MICA/MICB、ULBPs 的識別途徑清除腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。TSA 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面 MICA/MICB 高表達(dá)，促進(jìn) NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別 [21]。López-Soto 等 [22]發(fā)現(xiàn) TSA 可以促進(jìn) ULBPs 在上皮細(xì)胞瘤中的表達(dá)。

3.2 對抗原提呈細(xì)胞以及細(xì)胞因子的作用

抗原提呈細(xì)胞（APC）既是固有免疫的一部分，又能通過雙信號途徑激活 T 細(xì)胞，因此 APC 又是獲得性免疫的啟動者。而促炎細(xì)胞因子的釋放是許多疾病發(fā)生和發(fā)展的原因。HDACi 多次被證實阻礙 APC 協(xié)同刺激能力和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDM）和樹突狀細(xì)胞（BMDC）中，TSA 能顯著下調(diào)共刺激分子的表達(dá)以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生 [23-24]。該研究中，BMDC 經(jīng)由TSA 處理后，其表達(dá)的共刺激分子 CD40、CD80、CD86、CCR 與促炎性細(xì)胞因子 IL-6、IL-12、TNF-α 均被下調(diào) [24]。然而，在腹膜巨噬細(xì)胞中，TSA 上調(diào) IL-12 的同時下調(diào)IL-10 的表達(dá) [25]。對于兩種截然不同的研究結(jié)果，一種假說是 TSA 加入的時間點不同，第一組實驗 TSA 在抗原提呈細(xì)胞被激活前 1 小時加入，第二組實驗 TSA 與激活劑同時加入?？梢娍乖岢始?xì)胞的活化與否對 TSA 產(chǎn)生了不同的影響。與其形成鮮明對比的另一種假說是，TSA 在BMDM 中不僅沒有下調(diào) IL-12 的表達(dá)，相反可以防止IL-12 減少的產(chǎn)生。另有研究報道，TSA 通過減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生下調(diào)小鼠全身性炎癥反應(yīng) [26]。相似的效果在人類巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中也有呈現(xiàn)。此外，TSA 還影響轉(zhuǎn)錄因子的活化。Nencioni 等 [27]研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞來源的 DC 細(xì)胞中，TSA 通過阻斷 NF-κB 和 I 型 IFN信號通路減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并抑制 DC 的分化和功能。除此之外，在人類腫瘤細(xì)胞系和小鼠外周血中同時發(fā)現(xiàn)，TSA 可以減少促腫瘤生成細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）的產(chǎn)生 [28]?？偠灾琓SA 通過減少共刺激分子的表達(dá)以及促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來抑制抗原提呈細(xì)胞的功能。

3.3 TSA 對效應(yīng)淋巴細(xì)胞的作用

CD4 +效應(yīng) T 細(xì)胞是適應(yīng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要組成部分。研究顯示，HDACi 對 CD4 +細(xì)胞的細(xì)胞活性與功能具有抑制作用。Moreira 等 [29]用 TSA 處理小鼠 CD4 +細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，TSA 能夠抑制 PMA/ionomycin 刺激轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn) NF-κB 依賴的基因轉(zhuǎn)錄的能力，并伴隨時間的延長損害 CD4 +細(xì)胞的活性。TSA能夠影響 CD4 +細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)，這與其上調(diào)細(xì)胞周期性蛋白依賴性激酶抑制因子 p21 表達(dá)有關(guān) [30]。以上研究均顯示 TSA 妨礙 CD4 +細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。

在有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答中，CD8 +效應(yīng) T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用是至關(guān)重要的。一些研究顯示，HDACi 能增強CD8 +細(xì)胞的功能。TSA 能夠上調(diào)與 CD8 +活化和產(chǎn)生免疫記憶性相關(guān)基因的表達(dá)水平 [31]。研究表明，記憶性 CD8 +細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ 的能力依賴于 CD4 +輔助性細(xì)胞的存在，并且只有在 CD8 +記憶性 T 細(xì)胞中，IFN-γ 位點才能被高度乙酰化從而分泌大量 IFN-γ，迅速啟動抗腫瘤免疫功能[32]。

盡管 HDACi 抗腫瘤作用之一來源于 NK 細(xì)胞對腫瘤的識別能力，但是 HDACi 對 NK 細(xì)胞自身的作用報道并不多。Ogbomo 等 [33]首次證實聯(lián)合使用 HDACi 與 IL-2 可通過下調(diào) NK 細(xì)胞活化受體相關(guān)激活信號通路從而抑制人類 NK 細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞毒性作用。另一項研究同時證實，HDACi 對 NK 細(xì)胞功能的影響并非由于其誘導(dǎo) NK細(xì)胞凋亡所致，NK 細(xì)胞仍能通過釋放穿孔素、顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞 [34]。Rossi 等 [35]研究發(fā)現(xiàn)，TSA 抑制由 IL-12、IL-15 以及 IL-18 激活的 CD56dim/bright NK 細(xì)胞 IFN-γ的產(chǎn)生，并削弱 NK 細(xì)胞對 K562 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。同時 TSA 可持續(xù)下調(diào)靜止或活化的 NK 細(xì)胞表面受體NKG2D 以及 NKp46 的表達(dá)，并減少 NK 細(xì)胞表面分子CD25 的表達(dá)，導(dǎo)致其對 IL-2 的激活作用反應(yīng)遲鈍。該研究提示我們，以 TSA 為代表的 HDACi 在治療過程中對NK 細(xì)胞有一定的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能會削弱機體的免疫監(jiān)視功能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。

3.4 對調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的作用

調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞是一類控制自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞群體，包括 Treg 細(xì)胞、MDSC 細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）等。當(dāng)腫瘤發(fā)生時，這些細(xì)胞有利于機體腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。Foxp3 叉狀頭結(jié)構(gòu)區(qū)賴氨酸的高度乙?；欣?Treg 細(xì)胞獲得最佳功能，F(xiàn)oxp3 乙酰化后可以增強與 IL-2 啟動子的結(jié)合，從而抑制 IL-2 的表達(dá)。Do?as 等 [36]發(fā)現(xiàn) TSA 可增強 Foxp3基因的表達(dá)，促進(jìn) Treg 細(xì)胞分化及增殖并增強其免疫抑制能力。MDSC 細(xì)胞是未成熟的骨髓細(xì)胞，對 T 細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答有積極的抑制作用。Rosborough 等 [37]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用 TSA 及 GM-CSF 與單獨使用 GM-CSF 干預(yù)小鼠骨髓前體細(xì)胞培養(yǎng) 7 d 后，兩組細(xì)胞分化差異極大，TSA 能夠促進(jìn) MDSC 細(xì)胞的分化和增殖，表明組蛋白乙酰化能夠調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞向 MDSC 細(xì)胞分化。TAM 細(xì)胞表面 MHC II類分子低表達(dá)，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。有關(guān)研究證實，TAM 細(xì)胞對 TSA 的作用相當(dāng)敏感，TSA 可以恢復(fù) TAM 細(xì)胞MHC II 類分子的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)免疫抑制功能，延緩腫瘤的生長 [38]。總之，TSA 對調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的作用不盡相同，特別是其在腫瘤中對 MDSC 細(xì)胞和 TAM 細(xì)胞的作用需要進(jìn)一步探討。

4　展望

以 TSA 為代表的 HDACi 對機體免疫功能既有促進(jìn)作用也有抑制作用，其正性或負(fù)性作用的產(chǎn)生取決于免疫細(xì)胞的類型和活化狀態(tài)。盡管 TSA 對一些免疫細(xì)胞的細(xì)胞活性和功能有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，但越來越多的證據(jù)表明 TSA 與其他腫瘤免疫治療手段聯(lián)合使用能夠發(fā)揮較強的協(xié)同抗瘤作用。TSA 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性凋亡直接導(dǎo)致瘤體縮小，并且可以緩解機體免疫抑制狀態(tài)，促使腫瘤細(xì)胞更易被 NK細(xì)胞和 T 細(xì)胞識別。綜上所述，TSA 與腫瘤免疫治療的聯(lián)合使用前景廣闊，但兩者發(fā)揮協(xié)同作用的機制還需進(jìn)一步探討。