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    Rho/ROCK信號(hào)通路與間質(zhì)纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

    2015-01-22 12:10:58張蓓蓓
    關(guān)鍵詞:肌動(dòng)蛋白纖維細(xì)胞活化

    張蓓蓓,蔡 輝

    Rho/ROCK信號(hào)通路與間質(zhì)纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

    張蓓蓓,蔡 輝

    間質(zhì)纖維化是由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積引起的病理改變,是肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、高血壓、慢性腎炎、系統(tǒng)性硬化癥等多種疾病致死的主要原因。纖維化組織的重要特征是肌成纖維細(xì)胞(MFB)的出現(xiàn)。Rho/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架重組在MFB表型分化、收縮、遷移等行為中具有重要意義。阻斷Rho/ROCK信號(hào)通路是治療纖維化相關(guān)疾病的重要目標(biāo)。本文綜述了Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)MFB肌動(dòng)蛋白骨架的調(diào)節(jié),闡述了其在纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

    間質(zhì)纖維化;Rho;Rho激酶;肌成纖維細(xì)胞;肌動(dòng)蛋白骨架

    肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MFB)是參與損傷修復(fù)和纖維化的主要細(xì)胞。Rho/Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)信號(hào)通路介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架重組與MFB表型分化、收縮、遷移等行為關(guān)系密切。本文將對(duì)此進(jìn)行綜述,以期為治療纖維化相關(guān)疾病提供新的思路。

    1 Rho/ROCK信號(hào)通路

    Rho/ROCK信號(hào)通路廣泛參與生物體內(nèi)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、基因表達(dá)等行為。

    Rho包括RhoA、RhoB和RhoC三種異構(gòu)體。Rho分子內(nèi)GTP/ GDP結(jié)合域可以催化GTP水解,使Rho在活性型(GTP結(jié)合型)和失活型(GDP結(jié)合型)構(gòu)象之間循環(huán)。Rho羧基端的共同結(jié)構(gòu)域是翻譯后修復(fù)的位點(diǎn),其中包括異戊烯基轉(zhuǎn)移酶底物半胱氨酸殘基,只有經(jīng)過修飾的Rho才具有活性。Rho上游信號(hào)因子包括:Eph受體(ephrin receptor)、髓鞘相關(guān)抑制分子(myelin-associated inhibitors)、溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid,LPA)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine -1- phosphate,S1P)、凝血酶(thrombin)[1]、血栓素A2(thromboxane A2)及其他細(xì)胞因子受體等。Rho下游信號(hào)因子包括ROCK、p140mDia、蛋白激酶N(protein kinase N,PKN)、Rho結(jié)合蛋白(Rhophilin)和 Rho靶蛋白(Rhotekin)等[2]。

    ROCK是最早發(fā)現(xiàn)的Rho蛋白效應(yīng)分子,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶,包括高度同源的ROCK1和ROCK2兩個(gè)亞型。ROCK由N端的激酶結(jié)構(gòu)域、中間包含Rho結(jié)合區(qū)域(RBD)的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)及C末端富含半胱氨酸的PH結(jié)構(gòu)域(CRD)構(gòu)成。ROCK的底物包括肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(myosin phosphatase-targeting subunit-1,MYPT1)、肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)、LIM激酶(LIMK)、絲切蛋白(cofilin)、內(nèi)收蛋白(adducin)、ERM家族成員埃茲蛋白(ezrin)/根蛋白(radixin)/膜突蛋白(moesin)及中等纖維(intermediate filaments)成分波形蛋白(vimentin)/結(jié)蛋白(desmin)等。MYPT1/肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)[3]和LIMK/絲切蛋白是研究較為清楚的ROCK下游信號(hào)通路,與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架重組關(guān)系密切。

    C3轉(zhuǎn)移酶(C3 transferase) 因具有二磷酸腺苷(ADP)核糖基轉(zhuǎn)移酶活性,可以催化Rho功能區(qū)域的ADP核糖基化,使Rho失活,阻斷依賴Rho的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。羥甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶是Rho羧基端半胱氨酸殘基異戊烯化修飾的關(guān)鍵酶,他汀類藥物可以抑制此酶的活性,進(jìn)一步抑制ROCK。Y-27632和法舒地爾是非選擇性ROCK抑制劑,作用于三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合區(qū)域,已廣泛應(yīng)用于研究。另外,還有一些ROCK抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,包括Y39983/RKI983、SAR407899、AR12286、K115、INS117548、DE104、BA210和AMA0076等[4]。

    2 MFB與纖維化

    MFB兼有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征,是參與損傷修復(fù)和纖維化的主要細(xì)胞。在超微結(jié)構(gòu)上,包含α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的應(yīng)力纖維和超成熟黏著斑/纖維連接復(fù)合體是MFB最重要的特征。應(yīng)力纖維是胞漿內(nèi)纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-肌動(dòng)蛋白)和肌球蛋白組成的軸向束,是MFB主要的收縮結(jié)構(gòu)。其中,F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白是由單體肌動(dòng)蛋白即球狀肌球蛋白(G-肌動(dòng)蛋白)聚合而成。黏著斑為MFB特有的結(jié)構(gòu),主要由紐蛋白(vinculin)、張力蛋白(tensin)、樁蛋白(paxillin)、ED-A纖維連接蛋白(ED-A fibronectin)等黏著斑相關(guān)蛋白和整合素α、β亞基構(gòu)成,參與MFB的力/化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)的微絲(肌動(dòng)蛋白纖維)通過黏著斑和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中相關(guān)分子(如纖維連接蛋白)結(jié)合,將細(xì)胞錨定于基質(zhì)中,并感應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)。MFB具有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,合成膠原的效率較成纖維細(xì)胞顯著增加,還能自分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein -1)、各種基質(zhì)金屬蛋白酶等。

    機(jī)體受到炎癥、氧化應(yīng)激和缺血缺氧等刺激引起組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死和ECM結(jié)構(gòu)破壞時(shí),多種來源的成纖維細(xì)胞活化,發(fā)生肌動(dòng)蛋白骨架重組分化為MFB,加快組織修復(fù)?,F(xiàn)在普遍認(rèn)為,組織中固有成纖維細(xì)胞(resident fibroblasts)及臨近周細(xì)胞(pericytes)、循環(huán)中骨髓來源的纖維細(xì)胞(fibrocytes)、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都可以分化為MFB[5]。多種細(xì)胞因子、生長因子和ECM成分可以改變肌動(dòng)蛋白骨架,調(diào)節(jié)MFB分化,例如,TGF-β1、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase)能促進(jìn)MFB分化,堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor)、Smad7蛋白、脂質(zhì)過氧化體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor -γ)[6]則能抑制MFB分化。研究顯示,MyoD[7]和前列腺素E2(prostaglandin E2)[8]誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向MFB分化可以被逆轉(zhuǎn),說明MFB并非終末分化細(xì)胞。但MFB是通過凋亡,而不是去分化,消失于瘢痕組織中的[9]。

    MFB凋亡是終止修復(fù)反應(yīng)及恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵。皮膚的MFB在肉芽組織向成熟瘢痕進(jìn)展過程中全部凋亡,可不遺留瘢痕,但梗死后的心臟瘢痕中MFB可持續(xù)存在,有的長達(dá)20年。MFB耐受凋亡是發(fā)生纖維化的重要原因。以MFB為靶目標(biāo)的抗纖維化治療包括:阻礙MFB形成和分化;促進(jìn)MFB去分化;誘導(dǎo)MFB凋亡。

    3 Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì) MFB的調(diào)節(jié)

    成纖維細(xì)胞受到炎癥、損傷等刺激后,ROCK接受Rho傳遞的活化信號(hào)后,發(fā)生絲氨酸/蘇氨酸磷酸化而激活?;罨腞OCK進(jìn)一步磷酸化MLCP上的MLC結(jié)合亞單位,從而使MLCP活性下降,阻礙MLC脫磷酸化,提高成纖維細(xì)胞內(nèi)MLC的磷酸化水平,增加肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的交聯(lián),促使肌動(dòng)蛋白聚合、重組。肌動(dòng)蛋白骨架重組不僅是MFB分化的重要步驟,也是MFB收縮的重要?jiǎng)恿?。在損傷修復(fù)的早期,MFB收縮可阻止傷口擴(kuò)大,后期則引起瘢痕攣縮。

    抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路是治療纖維化相關(guān)疾病的有效方法[10]。Manickam等[11]研究發(fā)現(xiàn),干擾RhoA表達(dá)和抑制ROCK可以顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的腎MFB內(nèi)Nox4蛋白、α-SMA的表達(dá)和NADPH氧化酶的活性,改善腎纖維化。Lee等[12]報(bào)道,雌二醇通過抑制RhoA/ROCK/絲切蛋白信號(hào)通路,改善卵巢切除大鼠心肌梗死后纖維化,但合用Y-27632并不能增加治療效果。Porter等[13]發(fā)現(xiàn),辛伐他汀能抑制RhoA和ROCK的活性,阻止培養(yǎng)的人心房肌成纖維細(xì)胞增殖,改善心室重構(gòu)。Gu等[14]報(bào)道,ROCK抑制劑能阻止心臟瓣膜間質(zhì)成纖維細(xì)胞(valvular interstitial cells, VICs)突起(node)形成和α-SMA表達(dá),可能具有改善心臟瓣膜鈣化的作用。Huang等[15]報(bào)道,F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白解聚劑松弛素可使RhoA/ROCK信號(hào)通路失活,肌球蛋白輕鏈磷酸化(MFB收縮性的標(biāo)志)水平下降,對(duì)肺纖維化有治療作用。

    3.1 Rho/ROCK上游信號(hào) 以LPA和S1P為例。LPA和S1P同屬溶血磷脂類分子,均能與細(xì)胞膜上的相應(yīng)G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合,激活包括Rho在內(nèi)的下游信號(hào)分子,引起細(xì)胞基因表達(dá)、收縮、遷移等行為。

    Tangkijvanich等[16]發(fā)現(xiàn)LPA誘導(dǎo)的肝MFB遷移具有劑量依賴性和飽和性,可以部分被Y-27632和SB-202190(一種p38MAPK抑制劑)所阻斷,故溶血磷脂酸刺激的肝MFB遷移與Rho和p38MAPK有關(guān)。Parizi等[17]認(rèn)為鈣離子介導(dǎo)的MLCK活化,是LPA誘導(dǎo)的MFB收縮的必要條件,而非充分條件,單獨(dú)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高不足以使MFB收縮。而MLCK抑制劑(KT5926和ML-7)、C3-轉(zhuǎn)移酶、Y-27632可以抑制MFB收縮,說明LPA誘導(dǎo)的MFB收縮主要依賴于Rho/ROCK信號(hào)通路。Haak等[18]用LPA誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞作對(duì)照研究時(shí)發(fā)現(xiàn),LPA活化Rho,能促進(jìn)結(jié)締組織生長因子、Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)。Gellings 等[19]報(bào)道S1P和鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase,SPHK1,S1P產(chǎn)生的關(guān)鍵酶)依賴S1P2受體和ROCK,以自分泌或旁分泌的方式,提高TGF-β誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)和膠原合成,參與心肌纖維化。Kono等[20]發(fā)現(xiàn),SPHK1刺激TGF-β1誘導(dǎo)的人和小鼠肺成纖維細(xì)胞向MFB分化也與ROCK有關(guān)。

    3.2 Rho/ROCK下游信號(hào) 以心肌素相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(myocardin related transcription factors,MRTFs)/血清反應(yīng)因子(serum response factor,SRF)為例。MRTFs家族包括MRTF-A/MAL/ MKL1/BSAC 和MRTF-B/MKL2。MRTFs N端的RPEL區(qū)域與G-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合/解離狀態(tài)決定MRTF的活性。靜息狀態(tài)下,G-肌動(dòng)蛋白與內(nèi)輸?shù)鞍爪?β競爭性結(jié)合RPEL,阻止胞質(zhì)MRTF的核轉(zhuǎn)位。Rho活化后,細(xì)胞內(nèi)G-肌動(dòng)蛋白聚合成F-肌動(dòng)蛋白,釋放RPEL區(qū)域,MRTFs進(jìn)入細(xì)胞核,當(dāng)RPEL上的G-肌動(dòng)蛋白全部被移除時(shí),轉(zhuǎn)錄因子SRF被激活[18]。SRF在基因水平上調(diào)節(jié)α-SMA表達(dá)[18,21]。

    Zhao等[22]建立了一個(gè)能提供穩(wěn)定拉力的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),用于觀察組織預(yù)應(yīng)力對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的作用。在肌動(dòng)蛋白微絲完整的前提下,施加最大壓力10 min可誘導(dǎo)RhoA 活化,施壓10 min~20 min后發(fā)生肌動(dòng)蛋白微絲聚合。而轉(zhuǎn)染MRTF-A負(fù)性調(diào)節(jié)因子、抑制ROCK或者促使肌動(dòng)蛋白解聚可以完全阻斷應(yīng)力對(duì)α-SMA的表達(dá)。并認(rèn)為應(yīng)力介導(dǎo)的MFB分化與Rho/ ROCK/ LIMK/絲切蛋白途徑有關(guān)。

    Huang等[23]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)僵硬也可以活化RhoA/ROCK,誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)、MKL1核轉(zhuǎn)位和MFB分化。纖維化組織中,MFB持續(xù)分泌ECM引起的ECM硬度增加是促使纖維化持續(xù)進(jìn)展的重要因素。

    Sandbo等[24]用TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向MFB分化時(shí)發(fā)現(xiàn),肌動(dòng)蛋白聚合劑jasplakinolide能促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞MRTFs的核轉(zhuǎn)位、SRF活化、應(yīng)力纖維形成和α-SMA表達(dá),而促肌動(dòng)蛋白解聚劑Latrunculin B和Y-27632可以抑制以上過程。故推測(cè),TGF-β誘導(dǎo)肺MFB分化包括3個(gè)步驟:①Smad依賴的中間信號(hào)分子介導(dǎo)Rho活化和應(yīng)力纖維形成。②肌動(dòng)蛋白聚合引起MKL1核轉(zhuǎn)位和SRF活化。③SRF協(xié)助MKL1表達(dá),促進(jìn)MFB分化。

    Zhou等[25]在肺纖維化模型大鼠和特發(fā)性肺纖維化患者中均觀察到Rho/ROCK信號(hào)通路的活化,肌動(dòng)蛋白骨架的聚合和MKL1的核轉(zhuǎn)位。法舒地爾能下調(diào)BCL-2表達(dá),激活線粒體凋亡途徑,誘導(dǎo)MFB凋亡。在肺炎癥損傷后纖維化階段給予法舒地爾或者切除MKL1基因可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)大鼠肺纖維化的發(fā)生。

    4 小 結(jié)

    肺、心臟、肝、腎等器官慢性損傷通過激活Rho/ROCK信號(hào)通路及下游信號(hào)分子,誘導(dǎo)MFB分化、增殖、收縮、遷移等行為,參與損傷修復(fù),若MFB耐受凋亡并持續(xù)處于激活狀態(tài)則發(fā)生纖維化,晚期可引起器官功能衰竭。目前尚無切實(shí)有效的抗纖維化藥物。Rho/ROCK信號(hào)通路抑制劑對(duì)纖維化疾病顯示了良好的治療效果,有必要進(jìn)一步研究。

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    (本文編輯 郭懷印)

    南京軍區(qū)南京總醫(yī)院(南京210002)

    蔡輝,E-mail:njzy_caihui@163.com

    R363

    A

    10.3969/j.issn.1672-1349.2015.16.010

    1672-1349(2015)16-1844-04

    2015-08-18)

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