RNA干擾在生物基因治療中的應(yīng)用及意義

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(1.南華大學(xué),湖南 衡陽 421001；2.海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

·文獻(xiàn)綜述·

RNA干擾在生物基因治療中的應(yīng)用及意義

肖倩1,2,孫曉寧2*

(1.南華大學(xué),湖南 衡陽 421001；2.海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

RNA干擾(RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。RNAi以其高特異性、高效性等顯著優(yōu)勢將成為研究基因功能的全新手段，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本文擬就RNAi作用機(jī)制，及其在功能基因組學(xué)、基因治療(如腫瘤、病毒、自身免疫性疾病等)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀簡要作一綜述。

RNA干擾； 基因沉默； 功能基因組學(xué)； 基因治療

RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是指雙鏈RNA(double strands RNA，dsRNA)與細(xì)胞內(nèi)的同源序列mRNA相結(jié)合并使其降解的現(xiàn)象，從而特異抑制相應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng),是生物進(jìn)化過程中發(fā)展起來的自我保護(hù)機(jī)制。RNAi現(xiàn)象廣泛存在于各種生物中，如果蠅、水稻、小鼠及人類等，屬于RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式，對生物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。自發(fā)現(xiàn)以來，RNAi的研究取得了巨大的進(jìn)展，被廣泛用于探索基因表達(dá)調(diào)控、基因治療及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

RNA干擾現(xiàn)象最早應(yīng)追溯到1990年矮牽?；伾虻墓惨种片F(xiàn)象。1995年，Guo等[1]用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲par-1基因的表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)正義RNA具有與反義RNA同樣可以抑制該基因表達(dá)的作用。這一現(xiàn)象直到1998年才有了新的解釋，F(xiàn)ire等[2]推斷之前提到的ssRNA(single strand RNA,單鏈RNA)導(dǎo)致par-1基因沉默是因為制備單鏈時混有微量的dsRNA所致，發(fā)現(xiàn)這種抑制現(xiàn)象在原核生物中具有可遺傳性，將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾(RNA interference),簡稱RNAi。2001年Elbashir等[3]率先在哺乳動物細(xì)胞中觀測到了RNAi現(xiàn)象,從而開啟了RNAi技術(shù)在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用研究的閘門。2002年研究發(fā)現(xiàn)RNAi能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效沉默目標(biāo)基因的表達(dá)后，RNAi技術(shù)開始應(yīng)用在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。目前，實驗中常用的RNAi手段主要包括直接轉(zhuǎn)染小或短干擾RNA(sm1all/short interfering RNA，siRNA)以及轉(zhuǎn)染攜帶小或短發(fā)卡RNA(small/short hairpin RNA，shRNA)的質(zhì)粒。

2 RNAi的作用機(jī)制

RNAi的作用機(jī)制目前還不十分清楚。目前初步闡明RNAi發(fā)生的機(jī)制大致可分成3個階段：(1)啟動階段:外源性基因如病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因等隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞組內(nèi)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的dsRNA被一雙鏈RNA酶III型(Dicer酶)剪切成21～23nt的小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)。另外，siRNA的5′端磷酸化，3′端為羥基末端且有兩個不配對核苷酸，此結(jié)構(gòu)形式可能是siRNA進(jìn)入RNA干擾的通行證[4-5]。(2)效應(yīng)階段:siRNA與細(xì)胞內(nèi)的特異蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，但激活RISC得需要一個ATP依賴的siRNA解雙鏈的過程[5]。之后正義鏈RNA被置換出來，而反義鏈RNA仍結(jié)合在復(fù)合物上，從而形成具有生物活性的復(fù)合物。具有活性的RISC作用于與其上的單鏈siRNA序列互補(bǔ)的mRNA，由核酸內(nèi)切酶在距離siRNA 3′端12個堿基的位置將mRNA剪切成21～23 nt的片段,從而特異性地抑制了靶基因的表達(dá)[6]。(3)級聯(lián)放大階段:RISC與靶mRNA結(jié)合后以siRNA反義鏈為引物，以靶mRNA為模板，在RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下，將單鏈mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈。后者再由Dicer酶切割產(chǎn)生新的大量siRNA,使得RNAi的作用進(jìn)一步放大,最終把靶mRNA完全降解,從而顯著增強(qiáng)了對相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用[6-8]。

3 RNAi的應(yīng)用及意義

3.1 RNAi與功能基因組學(xué)

人類已經(jīng)進(jìn)入后基因組時代，基因組學(xué)的重心已由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，RNAi技術(shù)以其高度特異性、高效、操作簡單及周期短等特點，也就義不容辭的成為研究基因功能的強(qiáng)大工具。將功能未知的基因的編碼區(qū)(外顯子)或啟動子區(qū),以反向重復(fù)的方式由同一啟動子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA形成dsRNA產(chǎn)生RNA干涉，使得目的基因沉默，從而進(jìn)一步研究目的基因的功能[9]，使目的基因按照人們的意圖去表達(dá)。所以，RNAi能夠在后基因組時代里發(fā)揮其不一般的作用。

3.2 RNAi在基因治療中的應(yīng)用

RNAi作用的這種高度特異性有可能特異地抑制致病的突變等位基因，且又不影響正常的等位基因[9]，所以RNAi在治療疾病方面較傳統(tǒng)治療方法更有效而副作用更小。

3.2.1 RNAi與腫瘤 腫瘤是由多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常的結(jié)果，如果只針對單個突變基因進(jìn)行的腫瘤基因治療，效果并不理想。而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性設(shè)計，針對這一序列的dsRNA分子只需導(dǎo)入一種dsRNA就可以使多個基因同時沉默多種癌基因可以作為靶點設(shè)計相對應(yīng)的siRNA。目前RNAi對腫瘤進(jìn)行基因治療主要集中在與腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(如癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因)以及與腫瘤耐藥基因、細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)、有絲分裂及腫瘤血管生長等一系列有關(guān)的基因方面。如Zhang等[10]以人的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC7721為模型檢測到信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物5(signal transducer and activator of transcription 5,Stat5)(Stat5在人的多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá))在細(xì)胞系中高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)用RNAi介導(dǎo)的Stat5基因沉默可以抑制腫瘤細(xì)胞生長，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Qiu等[11]利用慢病毒包裝針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)基因的RNAi載體，導(dǎo)入結(jié)直腸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)VEGFA表達(dá)被抑制后，結(jié)果有效的抑制了腫瘤細(xì)胞的生長、遷移及增殖。以上研究說明RNAi的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的基因治療帶來了希望之光。

3.2.2 RNAi與病毒 RNAi是機(jī)體的一種由小分子RNA介導(dǎo)的序列特異性免疫保護(hù)性機(jī)制。RNAi能夠通過直接靶向病毒的mRNA從而導(dǎo)致病毒主要蛋白的降解[12-13]。RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)并且已經(jīng)成功抑制了多種病毒的復(fù)制。RNAi治療最關(guān)鍵的一點是尋找合適的靶點。到目前為止，幾乎所有的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)編碼和調(diào)控基因已經(jīng)被用作抗HIV RNAi治療的靶點并在體外實驗中得以驗證。其中效果比較好的有tat、rev基因等[14]。來自宿主的RNAi靶點，目前已經(jīng)通過實驗證明有效的包括NF-κB、CD4、趨化因子受體CCR5和CXCR4等，抑制這些分子的表達(dá)可以有效的抑制病毒復(fù)制和病毒感染過程[15-16]。此外，在體內(nèi)外的研究均證實了RNAi在抗乙型肝炎病毒[17-18](hepatitis B virus，HBV)、抗(hepatitis E virus，HEV)[19]等病毒感染中的作用。RNAi已成為抗病毒感染治療的有力工具。

3.2.3 RNAi與自身免疫性疾病 RNAi亦被用于自身免疫性疾病的研究。導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)關(guān)節(jié)退化的機(jī)制之一是滑膜細(xì)胞異?？沟蛲龅拇嬖?產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子和金屬蛋白酶。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的是一種常見的死亡受體,其中大部分屬于腫瘤壞死因子(TNF)的家庭。用抗TNF-α的單克隆抗體治療可顯著減少軟骨和骨侵蝕[20]。用siRNA技術(shù)沉默疾病相關(guān)基因的表達(dá)對RA的治療也具廣泛的應(yīng)用前景。如運用siRNA沉默樹突細(xì)胞中的CD40、CD80、和CD86可抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。慢病毒載體介導(dǎo)的TNF超家族成員B細(xì)胞激活因子的基因沉默，可抑制Th17細(xì)胞的增殖以改善小鼠中自身免疫性關(guān)節(jié)炎的病情[21]。Crispin等[22]用siRNA技術(shù)處理系統(tǒng)性紅斑狼瘡瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的T細(xì)胞，結(jié)果顯示白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的分泌水平得以恢復(fù)。而IL-2的減少是SLE最主要的免疫病理學(xué)表現(xiàn)。RNAi為各種自身免疫病的治療提供重要的理論和實驗依據(jù)，并發(fā)揮著重要作用。

3.2.4 RNAi與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病。對AD進(jìn)行的RNA干擾的研究也最為深入。AD主要表現(xiàn)為腦組織淀粉性斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[23]。淀粉樣斑塊由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解過程產(chǎn)生的β淀粉樣蛋白( β-amyloid protein，Aβ) 錯誤折疊組成。RNAi技術(shù)被用來減少體內(nèi)的Aβ肽，其原理是作用于APP水解蛋白水解過程所需的酶(如BACE1)的表達(dá)或者直接作用于APP的表達(dá)[24-25]。在不同情況下，Aβ肽水平的明顯減少與改善神經(jīng)病理學(xué)和記憶相關(guān)的表型有關(guān)。AD另外一個病理學(xué)特點是NFTs，它是由高度磷酸化的Tau組成[26]，Tau是AD的另一個治療靶點[27]。Tau似乎對于哺乳動物的功能來說并不是必不可少的，而且會引起一系列的神經(jīng)退化性疾病[28]。雖然沒有在AD模型的小鼠上直接以Tau的表達(dá)為目標(biāo)研究，但有研究在轉(zhuǎn)基因的AD小鼠模型上通過沉默細(xì)胞周期素依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)(CDK5是Tau高磷酸化所需要的酶)來阻礙NFTs的產(chǎn)生[29]。所以這項研究證實了CDK5也間接的證實了把Tau作為RNAi治療AD的靶點的可行性。

4 結(jié) 語

RNAi現(xiàn)象一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就成為科學(xué)研究的一大熱點，且在生物醫(yī)學(xué)方面的研究成果斐然，但仍有一系列問題亟待解決。如RNAi的具體作用機(jī)制、病毒的逃逸、如何把理論上可行的治療模型用于人體以及評價其作用效果等。相信隨著RNAi的深入研究，RNAi有望在將來成為一種高度特異的以核苷酸為基礎(chǔ)的基因治療技術(shù),不僅只應(yīng)用在腫瘤、抗病毒等治療中,甚至在功能性疾病的治療中發(fā)揮巨大作用。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.024

2014-10-24；

2014-12-10

海南省重點科技項目資助(ZDXM20100042).

*通訊作者，E-mail：xnsun-0108@163.com.

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(此文編輯：朱雯霞)