誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞在心血管疾病中的應(yīng)用

鄒琪 張新超

作者單位：100730北京醫(yī)院急診科

心血管疾病已經(jīng)成為人類最大的健康威脅，尋求有效的治療措施尤為迫切。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等多潛能干細(xì)胞可分化為帶有特定心肌細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞，具有心肌自主收縮功能，改善心臟功能，內(nèi)皮祖細(xì)胞可促進(jìn)心臟血管新生，或許干細(xì)胞治療能為治療心血管疾病提供新的契機(jī)。但多潛能干細(xì)胞分化不確定性、同種異體移植引起的移植排異反應(yīng)和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）倫理問(wèn)題阻礙了它的發(fā)展[1]。然而2006年發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPS）為干細(xì)胞治療帶來(lái)了新的希望。iPS細(xì)胞是Takahashi和Yamanaka用反轉(zhuǎn)錄病毒向鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入 Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc（OSKC）4種關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子獲得的一種類干細(xì)胞，可分化為內(nèi)、中、外3個(gè)胚層，具有生殖系傳遞和四倍體互補(bǔ)的干細(xì)胞特點(diǎn)[2]。將其與ESC進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩者在形態(tài)學(xué)、增殖能力、表面抗原、基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)和端粒酶活性等方面均非常相似[3-4]。由于此項(xiàng)技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要使用卵細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，所以避開了胚胎干細(xì)胞研究應(yīng)用帶來(lái)的倫理道德問(wèn)題和同種異體移植的排異問(wèn)題[5]。本文就iPS細(xì)胞在心血管疾病中的研究應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 iPS細(xì)胞的產(chǎn)生方法

1.1 反轉(zhuǎn)錄法

iPS細(xì)胞的來(lái)源十分豐富，目前已經(jīng)分別從人B淋巴細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、骨髓細(xì)胞成功獲得[6-9]。相比較而言，存儲(chǔ)量大、易獲得、損傷小的皮膚細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和尿液中尿路上皮細(xì)胞[10]更受到研究人員的青睞。iPS細(xì)胞除了用逆轉(zhuǎn)錄病毒制備外，腺病毒[11]、慢病毒[12]、仙臺(tái)病毒[13]、轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒表達(dá)載體[14]均能將轉(zhuǎn)錄因子插入體細(xì)胞，其中反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒表達(dá)基因相對(duì)穩(wěn)定，但安全性差；仙臺(tái)病毒安全性相對(duì)較高；腺病毒可不整合至宿主基因，致癌風(fēng)險(xiǎn)降低，但誘導(dǎo)效率極低且表達(dá)不穩(wěn)定；轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒表達(dá)載體的長(zhǎng)期安全性尚不明確。

從iPS細(xì)胞的安全性考慮，c-Myc作為致癌基因，重新激活可能導(dǎo)致腫瘤，而且過(guò)量表達(dá)癌相關(guān)基因會(huì)引起細(xì)胞凋亡和衰老[15]，研究人員嘗試使用無(wú) c-Myc的轉(zhuǎn)錄體系OSK[16]，或用L-Myc替代c-Myc[17]誘導(dǎo)iPS細(xì)胞。近期研究者們還通過(guò)生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)出了一組新的轉(zhuǎn)錄因子組合，包括 Sall4、Nanog、Esrrb 和 Lin28，稱為 SNEL，它們沒有依賴在體細(xì)胞基因組中比較活躍的部分：Oct4和Sox2，故能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高質(zhì)量的iPS細(xì)胞[18]。Shu等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，如果同時(shí)過(guò)表達(dá)中內(nèi)胚層和外胚層分化因子就可同時(shí)替代Oct4和Sox2，而細(xì)胞仍具有多潛能性，這一觀點(diǎn)打破了過(guò)去認(rèn)為將體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎酀撃芨杉?xì)胞，需要用在多潛能細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)，并且維持干細(xì)胞多潛能性的干性因子和調(diào)節(jié)發(fā)育與分化的因子是相互抑制的觀點(diǎn)，提示轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用可能在形成高質(zhì)量的iPS細(xì)胞的過(guò)程中扮演著重要的角色。還有研究發(fā)現(xiàn)，自噬過(guò)程對(duì)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生十分重要，Sox2能夠在重編程的早期下調(diào)mTOR的表達(dá)啟動(dòng)自噬。自噬作用在誘導(dǎo)第一天出現(xiàn)，第二天達(dá)到高峰，如果抑制Sox2會(huì)導(dǎo)致自噬作用不能啟動(dòng)，進(jìn)而無(wú)法獲得iPS細(xì)胞。

1.2 小分子復(fù)合物法

小分子復(fù)合物協(xié)同一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也可誘導(dǎo)iPS細(xì)胞產(chǎn)生[20]，其中CYT296可通過(guò)染色質(zhì)解聚使OSKM誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的效率增加10倍，并可與Oct4一起誘導(dǎo)細(xì)胞重編程[21]。Hou等[22]完全脫離轉(zhuǎn)錄因子，僅使用7個(gè)小分子組成ⅤC6TFZ（DZNep）化合物替代OSKM誘導(dǎo)鼠胚胎成纖維細(xì)胞獲得iPS細(xì)胞，稱為化學(xué)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞，其中C6FZ起決定作用。由于無(wú)轉(zhuǎn)錄因子參與，這可能是比較安全的誘導(dǎo)方法。

1.3 微小RNA法

微小RNA（miRNA）也可與轉(zhuǎn)錄因子共同誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程。Miyoshi等[23]報(bào)道了一套miRNA靶基因，包括P21、RBL2、MeCP2、TGFbR2、RHOC 等，耗竭這些基因可促進(jìn) iPS細(xì)胞形成，目前已經(jīng)成功將鼠和人成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。這種方法效率是OSKC方法的100倍以上，其原因可能是miRNA302抑制NR2F2，直接上調(diào)Oct4表達(dá)[24]。

2 iPS細(xì)胞在心血管疾病中的應(yīng)用

心血管疾病是危害人類健康的一大兇手，由于心肌細(xì)胞的再生能力較差，一旦出現(xiàn)壞死形成瘢痕組織，心臟功能便逐漸不可逆減退，最終發(fā)展為心功能衰竭，縮短生存期、影響患者生活質(zhì)量。iPS細(xì)胞的出現(xiàn)有望為心血管疾病的治療打開新局面、為致病機(jī)制研究提供新方法。

2.1 細(xì)胞治療

有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，人和鼠iPS細(xì)胞或iPS分化的心臟祖細(xì)胞可在體內(nèi)分化為心血管細(xì)胞系，形成新生血管，并通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)心臟再生[25]，縮小梗死范圍，減輕急性心肌梗死導(dǎo)致的左室功能不全和心肌重構(gòu)[26-27]。并有研究顯示，iPS細(xì)胞激活Notch通路，使Notch-1，Hes-1和pAkt表達(dá)上調(diào)，PTEN水平下降，減少血管和間質(zhì)纖維化[28]。Malecki等[29]使用生物工程的一種抗體作為橋梁，識(shí)別iPS細(xì)胞和心肌細(xì)胞表面的受體，將iPS細(xì)胞富集到梗死部位進(jìn)行心肌發(fā)育。近兩年iPS細(xì)胞技術(shù)已從實(shí)驗(yàn)室走向臨床研究，有3項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)已經(jīng)得出鼓舞人心的結(jié)論。SCIPIO試驗(yàn)（缺血性心肌病患者干細(xì)胞注射）是I期隨機(jī)公開試驗(yàn)。試驗(yàn)選取心肌梗死后左室功能障礙（LⅤEF＜40%）患者，冠狀動(dòng)脈注射自體心耳細(xì)胞誘導(dǎo)的c-Kit陽(yáng)性心臟祖細(xì)胞17例為試驗(yàn)組，7例為對(duì)照組。發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組LⅤEF明顯提高，治療1年和4年時(shí)LⅤEF分別提高8%和12%，梗死面積顯著降低，生活質(zhì)量明顯提高[30]；而CADUCEUS試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，治療組整體心臟功能雖無(wú)明顯改善，但活力心臟面積有所增加（6個(gè)月時(shí)減少7.7%，12個(gè)月時(shí)減少12.3%），局部心肌收縮功能好轉(zhuǎn)[31]。Naofumi的ALCADIA試驗(yàn)納入6例缺血性心肌病患者，取自體心內(nèi)膜心肌細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞，在CABG術(shù)中將自體心肌干細(xì)胞注入梗死部位（細(xì)胞數(shù)50萬(wàn)個(gè)/kg），再覆蓋含纖維生長(zhǎng)因子的可降解明膠細(xì)胞膜片，觀察6個(gè)月后患者的左室射血功能、梗死面積和臨床癥狀，隨訪1年的主要心臟事件。其中1例在術(shù)后3周發(fā)生急性梗死事件，1例在隨后1年的隨訪中心臟功能惡化，沒有其他嚴(yán)重不良事件發(fā)生。6個(gè)月后患者LⅤEF均有改善，超聲評(píng)估提高9%，MRI評(píng)估則提高了12%，梗死面積減少3.3%，而最大有氧運(yùn)動(dòng)能力增加 4.5 ml·kg-1·min-1[32]。幾個(gè)初步試驗(yàn)的結(jié)果，無(wú)疑在給缺血性心臟病的治療方法上提供了新的思路與空間，寄希望能徹底挽救心臟功能，提高患者生存率和生存質(zhì)量。

2.2 生物膜片和脫細(xì)胞骨架移植

隨著細(xì)胞重編程技術(shù)和組織工程的結(jié)合，細(xì)胞膜片和脫細(xì)胞骨架為iPS細(xì)胞移植提供了新的途徑[33]。Shimizu等[34]研究表明，細(xì)胞膜片移植的成功率要高于細(xì)胞注射，植入后膜片上存活的細(xì)胞還可持續(xù)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生化、減少纖維形成和募集干細(xì)胞至損傷部位，改善受損心臟的功能。增加移植部位的血運(yùn)可提高移植成功率。Kawamura等[35]使用iPS-CMs制成的心肌細(xì)胞膜片與帶蒂網(wǎng)膜一起植入豬的心臟，2個(gè)月后移植部位血管密度明顯增加，血運(yùn)豐富的位置有大量表達(dá)心臟肌鈣蛋白T的細(xì)胞。Sawa等[36]將其應(yīng)用于臨床，他們使用自體成肌細(xì)胞膜片經(jīng)胸腔鏡植入擴(kuò)張型心肌病患者的左心室外側(cè)，使患者心臟功能明顯提高。將細(xì)胞膜片重疊堆積，每層膜片形態(tài)和電傳導(dǎo)系統(tǒng)相互連接后可形成3D心臟組織，具有心臟組織樣搏動(dòng)，并能維持心臟形態(tài)學(xué)特征[37]。

多潛能細(xì)胞分化來(lái)的心肌細(xì)胞種植于脫細(xì)胞心臟骨架后可形成排列有序的心肌組織，產(chǎn)生同步收縮[38]。Lu等[39]使用人皮膚源iPS細(xì)胞分化出心臟祖細(xì)胞，將其附著在鼠心臟脫細(xì)胞骨架上，細(xì)胞可附著其上成長(zhǎng)并發(fā)展成心臟肌肉，歷經(jīng)20 d血液供應(yīng)后，此重建鼠器官再度以40～50次/min的頻率開始收縮。Bearzi等[40]通過(guò)生物工程方法獲得可分泌胎盤生長(zhǎng)因子（PIGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的iPS細(xì)胞，將其用水凝膠密封在聚乙二醇纖維蛋白原骨架上，植入心肌梗死模型小鼠的心肌，發(fā)現(xiàn)PIGF和MMP-9能促進(jìn)血管再生，改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。以上研究結(jié)果提示，iPS細(xì)胞不但可為同源器官提供新的來(lái)源，還可能用于心肌梗死、心力衰竭的治療，改善、抑制心力衰竭時(shí)發(fā)生心律失常。

2.3 建立疾病模型

目前，研究疾病致病機(jī)制和可能的治療方法通常是通過(guò)建立基因缺陷的動(dòng)物模型，但是將研究成果從動(dòng)物模型轉(zhuǎn)移到人還存在許多不確定性。iPS技術(shù)可取患者自身的體細(xì)胞重編程而成為患者自身特異性的iPS細(xì)胞系（PsiPS），從而就建立了人的疾病細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平、基因水平和表觀遺傳學(xué)水平對(duì)其進(jìn)行研究。一些不易制備動(dòng)物模型的罕見病癥，也可通過(guò)此方法來(lái)建模[41]。目前已經(jīng)建立PsiPS的疾病有長(zhǎng)QT綜合征、Timothy綜合征、兒茶酚胺敏感的多形性室速[12]、致心律失常右室心肌病[42]、左室發(fā)育不良[43]等，通過(guò)這些模型不但可研究遺傳性疾病的致病原因，還可用于藥物安全性、毒性測(cè)試。Drawnel等[44]已經(jīng)成功用2型糖尿病患者iPS細(xì)胞建立糖尿病心肌病藥物篩選模型，在體外篩選高糖環(huán)境下對(duì)心肌有保護(hù)作用的藥物。將此技術(shù)結(jié)合組織工程或可使疾病模型商業(yè)化，如Wang等[45]用Barth綜合征粒細(xì)胞心肌病患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，通過(guò)組織工程改造制成具有疾病形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的“心臟芯片”，通過(guò)基因替代和基因編程找到其致病原因?yàn)門AZ突變。另外，這項(xiàng)技術(shù)也可應(yīng)用于非遺傳性疾病，如在病毒性心肌炎的研究中，Sharma等[46]用表達(dá)熒光的柯薩奇病毒B3病毒株感染人iPS細(xì)胞，使其表達(dá)柯薩奇病毒和腺病毒受體，用于研究抗病毒藥物的療效和預(yù)測(cè)柯薩奇病毒易感人群。

3 小結(jié)與展望

iPS技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域具有里程碑意義，它為再生醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞治療注入新的希望，使醫(yī)學(xué)發(fā)展邁入一個(gè)新的臺(tái)階。但是多潛能干細(xì)胞的成瘤性仍然是限制其使用的主要原因，Ahmed等[47]發(fā)現(xiàn)分化程度低的iPS細(xì)胞易在移植后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，其原因可能是由于Oct4[48]和Nanog[49]的表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)使用二甲雙胍可抑制iPS細(xì)胞的成瘤性而不影響其多潛能分化。如果能保證它的安全性、高效性和特異性，將使目前臨床醫(yī)學(xué)產(chǎn)生革命性的變化，開辟疾病診治、藥物研究、器官移植的新途徑。