3型Stargardt病及其致病基因ELOVL4的研究進(jìn)展△

陸勤康 吳佩蓓 趙娜 劉昊

·綜 述·

3型Stargardt病及其致病基因ELOVL4的研究進(jìn)展△

陸勤康 吳佩蓓 趙娜 劉昊＊

3型Stargardt病(STGD3，MIM600110)是一種常染色體顯性遺傳的早發(fā)性黃斑營(yíng)養(yǎng)不良性疾病，是一種單基因遺傳性疾病。目前為止，已知的STGD3致病基因?yàn)闃O長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶4基因(ELOVL4)。ELOVL4是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種調(diào)節(jié)極長(zhǎng)鏈飽和及多不飽和脂肪酸生物合成的限速縮合反應(yīng)中不可或缺的膜蛋白。作為一種遺傳性疾病，STGD3目前仍無有效治療方法。然而，飲食補(bǔ)充極長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸可能是治療STGD3的一種可行療法。對(duì)STGD3基因及致病機(jī)制的研究可能將有助于發(fā)現(xiàn)STGD3的有效治療方法及進(jìn)一步了解其他遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病和更復(fù)雜的年齡相關(guān)性黃斑變性。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：441-444)

Stargardt病(STGD)是一種遺傳性黃斑變性疾病，常于6～20歲起病，表現(xiàn)為雙眼漸進(jìn)性的中心視力下降、黃斑萎縮性變化、眼底黃色斑點(diǎn)和暗脈絡(luò)膜熒光等。根據(jù)臨床表現(xiàn)及致病基因的不同，該病曾被分為STGD1、STGD2、STGD3及STGD4 4種亞型。后研究發(fā)現(xiàn)STGD2的致病基因與STGD3相同，故目前已取消STGD2。其中，STGD1呈常染色體隱性遺傳，為STGD的主要亞型，致病基因?yàn)槲挥谌旧w1p21-p22.1的視網(wǎng)膜特異性ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)基因(adenosine triphosphate-binding cassette transporter gene，ABCA4)，曾被稱為ABCR[1-2]。STGD3及STGD4則呈常染色體顯性遺傳。STGD3的致病基因?yàn)槲挥谌旧w6q14的極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶4基因(elongation of very long chain fatty acid elongase 4，ELOVL4)[3-4]。STGD4的致病基因位于染色體4q，但致病基因仍不明確。除此之外，有報(bào)道[5-6]稱少數(shù)STGD或“STGD-like”表型病也伴有CRB1，PROM1,RDS/PRPH2, VMD2 (BEST1)等基因變異。由于這些病例報(bào)道依然較少，其致病機(jī)制及存在于哪一類或幾類STGD亞型尚不明確，因此本文不再詳述。

由于STGD3是一種對(duì)患者視功能造成嚴(yán)重影響的遺傳性黃斑變性疾病，且目前該病的遺傳學(xué)病因及致病機(jī)制仍不明確，對(duì)STGD3的遺傳學(xué)和致病機(jī)制的進(jìn)一步研究可能有助于發(fā)現(xiàn)該病的有效治療方法，和增強(qiáng)對(duì)其他遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病進(jìn)一步了解，故對(duì)STGD3的基因研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 STGD3的臨床表現(xiàn)

STGD3由Klien和Krill于1967年首先報(bào)道[7]。STGD3表現(xiàn)為雙眼漸進(jìn)性的中心視力下降、黃斑萎縮性變化、伴或不伴眼底黃色斑點(diǎn)和無暗脈絡(luò)膜熒光等。STGD常起病于6～20歲，但本病起病年齡范圍較廣，6～70歲均可起病[5,8-10]。中心視力損害常先于視網(wǎng)膜改變出現(xiàn)。隨后雙眼眼底出現(xiàn)黃斑萎縮性改變，伴或不伴黃色斑點(diǎn)?；颊叩难鄣赘淖儠?huì)隨年齡增長(zhǎng)而逐漸進(jìn)展，中心視力也將漸進(jìn)性下降。STGD3在脈絡(luò)膜熒光血管造影檢查中，常無暗脈絡(luò)膜熒光表現(xiàn)，這是STGD3區(qū)別于STGD1的特征表現(xiàn)[8,11]。STGD3患者老年時(shí)視力常低于20/200，色覺輕度受損或與視力改變一致，ERG常無變化或輕度下降[8,10]。然而，STGD3患者的臨床表現(xiàn)可有廣泛變異，并無一個(gè)絕對(duì)的臨床表現(xiàn)模式[11]。由于STGD3臨床表現(xiàn)的多變性及與其他顯性遺傳視網(wǎng)膜疾病的相似性，如視錐視桿營(yíng)養(yǎng)不良、中心性脈絡(luò)膜萎縮及視網(wǎng)膜色素變性的某些亞型，導(dǎo)致較難將STGD3和這些疾病相鑒別[10]。

2 STGD3的基因研究

Stone等[8]于1994年在一個(gè)龐大的STGD3家系中進(jìn)行了連鎖分析，并將致病基因定位于6號(hào)染色體長(zhǎng)臂位于標(biāo)記D6S313和D6S252之間的18cM區(qū)域。在同一年，Zhang等[12]對(duì)一個(gè)來自美國印第安納州的龐大常染色體顯性遺傳STGD家系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)染色體13q34上位于D13S159和D13S174之間的8cM區(qū)域可能和該病相關(guān)，并且把該病命名為STGD2。然而，在2001，Zhang等[3]又對(duì)這個(gè)家系中起初因年齡太小而不能明確診斷的孩子做進(jìn)一步的研究，基因連鎖及單倍體分析顯示，該家系的致病基因位點(diǎn)為STGD3的6q14，從而消除了先前提出的STGD2亞型及其致病位點(diǎn)13q34。并且，STGD2也已從OMIM數(shù)據(jù)庫及RetNet數(shù)據(jù)庫(www.sph.uth.tmc.edu/Retnet)中消除[10]。2000年，Griesinger等[9]在一個(gè)表型與STGD3相似的常染色體顯性遺傳性黃斑營(yíng)養(yǎng)不良的家系中進(jìn)行單倍型分析，將致病基因定位于染色體6q14上的一個(gè)8cM區(qū)域，該區(qū)域位于STGD3的18cM范圍內(nèi)。

3 ELOVL4基因致病機(jī)制研究

2001年，Zhang等通過定位候選基因法，在患有STGD3或常染色體顯性遺傳性黃斑營(yíng)養(yǎng)不良的5個(gè)相關(guān)家系中的所有患者中，發(fā)現(xiàn)了ELOVL4基因6號(hào)外顯子內(nèi)的5bp缺失(790-794 del AACTT)。這是首次發(fā)現(xiàn)ELOVL4基因——新的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性基因，并提示它所介導(dǎo)的脂肪酸生物合成參與了遺傳性黃斑變性的發(fā)生。這個(gè)缺失導(dǎo)致了移碼突變，導(dǎo)致了在C末端包括雙賴氨酸定位信號(hào)在內(nèi)的51個(gè)氨基酸片段的缺失，并導(dǎo)致從氨基酸264～271合成異常的肽鏈，之后是一個(gè)提前出現(xiàn)的終止密碼子[3]。隨后，Edwards等[4]在一個(gè)龐大的家系中證實(shí)了這一突變。同一年，Strom等在一個(gè)美國猶他州患有STGD3相似表型疾病的獨(dú)立家系中，發(fā)現(xiàn)了ELOVL4基因6號(hào)外顯子中的一種兩個(gè)相隔4 bp的1 bp缺失(789ΔT + 794ΔT)復(fù)雜突變。該突變導(dǎo)致了移碼突變，ELOVL4蛋白被截?cái)?，造成與先前發(fā)現(xiàn)的5 bp缺失相似的后果[5]。2004年，Maugeri等在一個(gè)有STGD3疾病特征的不相關(guān)歐洲家系中，發(fā)現(xiàn)了位于ELOVL4基因6號(hào)外顯子中一個(gè)新的810C→G(Y270X)突變。這個(gè)突變導(dǎo)致270酪氨酸變成了終止密碼子(Y270X)，蛋白截?cái)嗉白詈?5個(gè)氨基酸的丟失。此外，他們進(jìn)行了轉(zhuǎn)染研究，發(fā)現(xiàn)與野生型ELOVL4不同，突變蛋白不定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而以聚合物的形式出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中[6]。3個(gè)已知的突變都位于ELOVL4基因相似的位置，都導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留所需的雙賴氨酸結(jié)構(gòu)域的遺傳信息缺失,即缺陷ELOVL4蛋白在C末端被截?cái)?，?dǎo)致缺陷蛋白錯(cuò)誤定位和聚集。

人類ELOVL4基因是一個(gè)具有6個(gè)外顯子的32.7 kb基因。ELOVL4 cDNA的完整測(cè)序表明，ELOVL4基因編碼一個(gè)314個(gè)氨基酸的蛋白酶，約35%的氨基酸與在酵母中參與脂肪酸鏈延伸的脂肪酸延長(zhǎng)酶(elongase of fatty acids，ELO)家族成員同源[3,13]。ELOVL4是一種膜內(nèi)在蛋白，擁有所有ELO家族成員的3個(gè)特征：預(yù)測(cè)的5個(gè)跨膜片段、C末端的雙賴氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)(KXKXX)、一個(gè)單一的二氧化鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HXXHH)[14]。ELOVL4蛋白酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上介導(dǎo)極長(zhǎng)鏈(≥C28)飽和及多不飽和脂肪酸生物合成的限速縮合反應(yīng)[15]。ELOVL4是新發(fā)現(xiàn)的一種在維持視網(wǎng)膜感光細(xì)胞活性方面發(fā)揮重要作用的特異性蛋白酶。目前研究[16]已證實(shí)，ELOVL4這3個(gè)已知的突變均可導(dǎo)致視網(wǎng)膜黃斑部退化變性，中心視力下降，視物色暗、變形，最終可致盲。ELOVL4突變發(fā)生在保守的組氨酸結(jié)構(gòu)域下游，保留了活性位點(diǎn)，但形成了被截?cái)嗟那义e(cuò)誤定位到高爾基復(fù)合體或在培養(yǎng)細(xì)胞中形成聚合物的蛋白，不能發(fā)揮生物活性[17-19]。同樣，突變型ELOVL4也并不會(huì)影響野生型ELOVL4的生物活性[20]。

因此，在STGD3患者中光感受器細(xì)胞的死亡，可能是通過3種通路：①極長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸減少可能影響感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能；②截短蛋白的錯(cuò)誤分布對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生壓力；③截短蛋白保留活性中心的酶活性產(chǎn)生有毒產(chǎn)物(3-酮中間體)[21]。截短ELOVL4蛋白有毒酮中間體的生產(chǎn)和蓄積導(dǎo)致極長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的合成進(jìn)一步減少。Logan等[22]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，即使截?cái)嗟鞍妆Ａ袅嘶钚灾行?，錯(cuò)誤定位的STGD3截?cái)嗟鞍兹狈?nèi)在酶活性。他們發(fā)現(xiàn)，將截短蛋白重新定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也無法恢復(fù)其功能。因此，由于基因突變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)修飾致使STGD3蛋白質(zhì)失去活性。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，雖然在培養(yǎng)細(xì)胞中有與截短蛋白表達(dá)相關(guān)的形態(tài)學(xué)明顯改變，但它并沒有上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。在培養(yǎng)細(xì)胞中，過表達(dá)的標(biāo)記STGD3突變對(duì)野生型ELOVL4的定位表現(xiàn)出顯性負(fù)效應(yīng)[6,16-18,23]。截短突變蛋白能抑制野生型ELOVL4合成極長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。當(dāng)突變蛋白被重新定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上時(shí)，這種抑制作用加強(qiáng)。他們使用無細(xì)胞微粒體測(cè)定法進(jìn)一步證明，截短蛋白即缺乏內(nèi)在活性又抑制野生型ELOVL4的縮合活性，從而發(fā)揮顯性負(fù)效應(yīng)[20]。此外，雖然ELOVL4主要存在于視網(wǎng)膜，但并非僅限于此，其mRNA在皮膚、大腦和睪丸同樣有高表達(dá)[24]。

4 ELOVL4基因突變STGD3的動(dòng)物模型

由于小鼠和人類基因組間具有90%的相似性，且小鼠生命周期短(約2年)、費(fèi)用便宜，目前最廣泛應(yīng)用的STGD3動(dòng)物模型仍是小鼠模型。然而，小鼠模型的缺點(diǎn)是，視網(wǎng)膜上沒有黃斑。但是，人們也越來越多地認(rèn)識(shí)到黃斑疾病不僅影響黃斑區(qū)，而會(huì)影響整個(gè)視網(wǎng)膜，也有很多已知的人類黃斑疾病基因或突變嵌入小鼠后，導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜疾病的證據(jù)[25-26]。

STGD3是一種常染色體顯性遺傳性疾病。單倍劑量不足及顯性負(fù)效應(yīng)是顯性基因突變致病的2種典型途徑。單倍劑量不足是指一個(gè)基因的正常單拷貝不能產(chǎn)生足夠蛋白質(zhì)來表現(xiàn)出野生表型。顯性負(fù)效應(yīng)是指突變基因產(chǎn)物對(duì)野生型產(chǎn)物的抑制作用，導(dǎo)致了功能基因產(chǎn)物減少。為了明確STGD3的機(jī)制，一些小鼠模型已根據(jù)視網(wǎng)膜表型被制作并評(píng)估。這些小鼠模型可分為3類：①ELOVL4基因缺失的基因敲除小鼠模型；②添加ELOVL4基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型；③ELOVL4基因替換的敲入小鼠模型。3組小鼠模型中，帶有純合ELOVL4突變基因型的小鼠都由于皮膚屏障功能受損而發(fā)生新生兒致死[27]。因此，以下所有研究的小鼠模型都是雜合子。在基因敲除小鼠模型中，通過針對(duì)性地刪除ELOVL4基因的2號(hào)外顯子產(chǎn)生了兩個(gè)ELOVL4基因敲除小鼠模型(KO1和KO2)，導(dǎo)致了敲除ELOVL4基因不能表達(dá)ELOVL4蛋白，來確定是否由于單倍劑量不足致病[28-30]。2種模型中，雜合基因敲除小鼠和野生型小鼠對(duì)比，只有細(xì)微的視網(wǎng)膜形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)差別，提示單倍劑量不足不是導(dǎo)致STGD3的分子機(jī)制。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，許多通過基因添加或基因替代方法制作的小鼠模型被用于檢測(cè)是否是由顯性負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致了STGD3。3種不同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物株系，轉(zhuǎn)基因株系(transgenic line)1、2、3(TG1、TG2、TG3)，是通過整合人類的ELOVL4基因5 bp缺失突變而產(chǎn)生的，表現(xiàn)出漸進(jìn)性視網(wǎng)膜變性和RPE脂褐素累積[18]。感光細(xì)胞的變性程度和ELOVL4突變轉(zhuǎn)基因的表達(dá)成正比。在敲入小鼠模型中，ELOVL4基因5 bp缺失突變被引入小鼠的同源ELOVL4基因單拷貝中的2種敲入小鼠模型是分別由Vasireddy等[31](KI小鼠系)和McMahon等[32](KI+ 2小鼠系，在5 bp缺失突變的下游有另外2個(gè)點(diǎn)突變，這樣這個(gè)區(qū)域的序列就和人類STGD3基因的DNA序列一致了)獨(dú)立制作的。人類STGD3的表現(xiàn)在KI和KI + 2小鼠系中而被重現(xiàn)，除5 bp缺失基因敲入小鼠模型以外，還有第3個(gè)通過引入Y270X缺失突變產(chǎn)生的模型。然而，Y270X模型的視網(wǎng)膜表型尚未見報(bào)道。總之，在轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠模型中，已知的5bp STGD3等位基因的引入，導(dǎo)致了顯性負(fù)效應(yīng)，而ELOVL4單倍劑量不足則不是STGD3的致病機(jī)制。由于小鼠視網(wǎng)膜無黃斑，小鼠模型并不是人類STGD3很好的模型。豬的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的分布與人類視網(wǎng)膜更相似，它包括視錐細(xì)胞豐富區(qū)，如黃斑中央?yún)^(qū)。近年來，Sommer等[33]制作了4個(gè)Y270X豬系和一個(gè)5bp缺失轉(zhuǎn)基因豬模型來更好地模擬STGD3的病理學(xué)改變。

5 未來研究方向

目前為止，尚無STGD3的有效治療方法。然而，由于假定的ELOVL4功能，已有許多研究被設(shè)計(jì)來確定攝入脂肪酸對(duì)STGD3的療效。在補(bǔ)充DHA用于治療STGD3的動(dòng)物模型中，結(jié)果也是不一致的[34-35]。也有關(guān)于人的脂肪及紅細(xì)胞脂質(zhì)與由ELOVL4突變引起STGD3嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究。這些結(jié)果表明， STGD3家系的表型多樣性可能與飲食中脂肪攝入量的差異有關(guān)，脂肪攝入量差異可通過脂肪和紅細(xì)胞脂質(zhì)反映[36]。在另一項(xiàng)研究中，1例15歲的STGD3患者補(bǔ)充了2個(gè)月DHA后，通過主觀的調(diào)查問卷和客觀的多焦視網(wǎng)膜電圖(mfERG)檢查均表現(xiàn)出視功能改善[35]。因此，膳食補(bǔ)充極長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸可能是STGD3的一種可行療法。膳食補(bǔ)充治療結(jié)合由核酶或RNAi介導(dǎo)的對(duì)缺陷基因產(chǎn)物的基因敲低療法，通過解除顯性負(fù)效應(yīng)以及改變感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，可能使患者進(jìn)一步受益。對(duì)STGD3的遺傳學(xué)和致病機(jī)制的進(jìn)一步研究，可能有助于發(fā)現(xiàn)該病的有效療法，和增強(qiáng)對(duì)其他遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病及更復(fù)雜的年齡相關(guān)性黃斑變性的進(jìn)一步了解。

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[30] Cameron DJ, Tong Z, Yang Z, et al. Essential role of elovl4 in very long chain fatty acid synthesis, skin permeability barrier function, and neonatal survival[J]. Int J Biol Sci, 2007, 3(2): 111-119.

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(本文編輯 諸靜英)

試題8.答案：B。梅毒患者瞳孔的經(jīng)典表現(xiàn)是阿羅瞳孔(Argyll Robertson瞳孔)。在早期神經(jīng)梅毒可見，但在晚期更常見。瞳孔大小不規(guī)則，極度縮小，近光反應(yīng)分離，近光反應(yīng)分離在正常大小的瞳孔更常見。阿羅瞳孔的瞳孔縮小，不應(yīng)與Homer綜合征的小瞳孔相混淆，前者可能伴有神經(jīng)性梅毒,常與Roeder綜合征有相同的臨床特點(diǎn)。盡管類阿羅瞳孔更常見于神經(jīng)性梅毒，但在多發(fā)性硬化、糖尿病、酒精中毒、大腦炎也可見。鑒別它們最主要的特點(diǎn)是瞳孔大小，神經(jīng)性梅毒以極小瞳孔為其特點(diǎn)。劉家琦，李鳳鳴. 實(shí)用眼科學(xué). 3版. 人民衛(wèi)生出版社，2014：625-627。

試題9.答案：D。弱視是一種單眼或雙眼(雙眼較少)最佳矯正視力低于正常，而未能發(fā)現(xiàn)與該視力減退相對(duì)應(yīng)的眼球器質(zhì)性改變。分為斜視性弱視、屈光參差性弱視、屈光不正性弱視、形覺剝奪性弱視。視網(wǎng)膜病變的視力下降是器質(zhì)性改變引起的，不屬于弱視。劉家琦，李鳳鳴. 實(shí)用眼科學(xué). 3版. 人民衛(wèi)生出版社，2014：595-598。

試題10.答案：B。CNV又稱視網(wǎng)膜下新生血管，可能的原因有變性疾?。豪夏挈S斑變性、視盤玻璃膜疣和眼底血管樣條紋癥等；遺傳性黃斑變性： Best病、Stargardt病、黃色斑點(diǎn)視網(wǎng)膜變性等；炎癥性疾病：弓形體蟲病、匍行性脈絡(luò)膜炎、風(fēng)疹性視網(wǎng)膜病變、結(jié)節(jié)病等；腫瘤；損傷：脈絡(luò)膜破裂、氬激光治療或視網(wǎng)膜冷凝損傷后的晚期并發(fā)癥等。葛堅(jiān)，等. 眼科學(xué). 2版. 人民衛(wèi)生出版社，2011：289-290。

浙江省自然科學(xué)基金(LY12H12001)；寧波市社會(huì)民生科技重大項(xiàng)目(2014C50091)；寧波市鄞州區(qū)科技項(xiàng)目(鄞科2013-90)

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州醫(yī)院(鄞州人民醫(yī)院)眼科中心 寧波 315041；＊香港理工大學(xué)眼科學(xué)院和醫(yī)療科技及資訊學(xué)系 九龍 999077通訊作者：陸勤康(Email: luqinkang@163.com; ranyonglanA9@gmail.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.021

2015-04-07)