誘導(dǎo)多能干細(xì)胞成軟骨方向分化的研究進(jìn)展*

鄭育亮 張志光

1. 軟骨的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

軟骨的主要功能是給運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)提供減震和潤滑作用。分布于人體內(nèi)的軟骨可分為：纖維軟骨、彈性軟骨和透明軟骨三種類型。顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨屬于纖維軟骨。從關(guān)節(jié)表面向下，軟骨可分五層：①纖維層：成纖維樣細(xì)胞包裹在富含Ⅰ型膠原的纖維基質(zhì)中；②增殖層：細(xì)胞呈多形性，包含軟骨祖細(xì)胞；③成熟層：細(xì)胞扁平，能夠分泌不含Ⅱ型膠原的前軟骨基質(zhì)；④前肥大層：細(xì)胞呈典型的軟骨細(xì)胞樣，活躍分泌Ⅱ型膠原并將其沉積在軟骨基質(zhì)中；⑤肥大層：由終末分化的擴(kuò)張軟骨細(xì)胞構(gòu)成，軟骨基質(zhì)礦化。軟骨內(nèi)無血管神經(jīng)分布，故軟骨的損傷難以自我修復(fù)。

2. 造成軟骨損傷的原因

常見的造成軟骨損傷的原因主要由以下兩個(gè)原因造成:

2.1 外傷造成的軟骨損傷 軟骨由于其自身的修復(fù)能力很弱，在受到外來因素的損傷后，常常難以自我修復(fù)。淺表性的軟骨損傷，常常會(huì)發(fā)展成軟骨下層的損傷。此時(shí)，位于軟骨下層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)迅速遷徙到損傷處，發(fā)揮自我修復(fù)損傷的功能，但是，損傷后修復(fù)的組織在機(jī)械性能，耐摩擦性能上均比原先正常的軟骨組織差很多[1]，在活動(dòng)頻繁的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中會(huì)逐漸磨損、降解，最后導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)骨質(zhì)破壞，形成骨關(guān)節(jié)病(Osteoarthritis，OA)。

2.2 關(guān)節(jié)軟骨退化造成的軟骨損傷 隨著年齡的增長，關(guān)節(jié)在日常生活中常常處于負(fù)重狀態(tài)，尤其是一些不良習(xí)慣造成的關(guān)節(jié)非正常負(fù)重，是造成承重關(guān)節(jié)軟骨損傷、退行性病變的主要原因。

3. 軟骨損傷缺損后的治療

由于軟骨特異的組織結(jié)構(gòu)，目前還無特效藥物可以治療各種原因?qū)е碌能浌菗p傷。而傳統(tǒng)的外科手術(shù)方法又難以達(dá)到令人滿意的治療效果。關(guān)節(jié)軟骨下層存在著骨髓細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)祖細(xì)胞，當(dāng)軟骨損壞缺損到達(dá)軟骨下層后，受到刺激的骨間充質(zhì)祖細(xì)胞會(huì)迅速作出反應(yīng)，聚集到病變位置，修復(fù)病變位置的骨質(zhì)缺損。正是基于這個(gè)理論，德國醫(yī)生Steadman 在此基礎(chǔ)上發(fā)明了微骨折技術(shù)(Microfracture techniques)[2]，該技術(shù)是目前在治療軟骨損傷和缺損上經(jīng)常用到的外科手術(shù)技術(shù)。但是這種修復(fù)還是存在一定的缺陷，由于修復(fù)的組織主要以富含I 型膠原纖維的纖維軟骨為主，機(jī)械性能差，耐摩擦能力差，在短期內(nèi)可恢復(fù)病變關(guān)節(jié)的部分功能，但是長期效果不理想[1]。其他的治療方法，例如自體軟骨移植和同種異體軟骨移植，雖然也可在一定程度上修復(fù)關(guān)節(jié)的骨質(zhì)缺損，但是由于存在第二供區(qū)的損傷，在臨床上的使用受到一定的限制，難以廣泛開展應(yīng)用。iPS 細(xì)胞的出現(xiàn)，為軟骨損傷和缺損的治療提供了新的途徑。

4. 體細(xì)胞重編程及iPS 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

哺乳動(dòng)物自受精卵開始發(fā)育到成熟個(gè)體的過程，也是全能、多能干細(xì)胞逐漸分化為成體細(xì)胞的過程，一直以來，這一過程被認(rèn)為是不可逆的，直到體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn)，人們才意識(shí)到，個(gè)體發(fā)育的這個(gè)過程，在一定條件下也是可以被逆轉(zhuǎn)的。上世紀(jì)60 年代初，英國科學(xué)家John Gurdon利用體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技術(shù)，將非洲爪蟾的體細(xì)胞核移植到卵細(xì)胞中，該細(xì)胞經(jīng)過發(fā)育最終得到了一只完整的個(gè)體[3，4]。1997 年，科學(xué)家Ian Wilmut 和他的研究團(tuán)隊(duì)利用類似的體細(xì)胞核移植技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的“克隆”[5]，克隆羊“dolly”由此誕生。2012 年，首次將該技術(shù)應(yīng)用到了靈長類動(dòng)物的美國科學(xué)家Shoukhrat Mitalipov 利用SCNT 技術(shù)得到了恒河猴的ESCs。2013 年，他們利用該技術(shù)獲得了人胚胎干細(xì)胞[6]。SCNT 技術(shù)使科學(xué)家們意識(shí)到，成熟的體細(xì)胞在一定的條件下，是可以被重編程回到多能性狀態(tài)的。隨之科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)另一種技術(shù)，細(xì)胞融合(cell fusion)技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)這一逆轉(zhuǎn)過程。1997 年，Masako Tada 等[7]利用細(xì)胞融合(cell fusion)技術(shù)將體細(xì)胞與胚胎生殖細(xì)胞(Embryonic germ cells，EG)融合之后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的表觀遺傳學(xué)變化，一些已經(jīng)沉默的基因又重性被激活表達(dá)了。但是，由于涉及胚胎干細(xì)胞的研究，避免不了要面對(duì)倫理道德宗教信仰方面的阻礙，直到2006 年，日本科學(xué)家Shinya Yamanaka 帶領(lǐng)他的研究團(tuán)隊(duì)，改變了這一現(xiàn)狀。他們通過將Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小鼠體細(xì)胞后，得到一類形態(tài)和功能類似于胚胎干細(xì)胞的多能干細(xì)胞，稱之為誘導(dǎo)多能干 細(xì) 胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)[8]。2007 年，Yamanaka 和Junying Yu 同時(shí)發(fā)表論文，利用同樣的方法將人的皮膚細(xì)胞重編程回到多能性狀態(tài)，不過Junying Yu 使用的轉(zhuǎn)錄因子是Oct4、Sox2、Nanog 和Lin28，與Yamanaka 的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中有兩個(gè)不相同[9，10]。長久以來，胚胎干細(xì)胞的研究飽受其細(xì)胞來源、倫理道德及宗教信仰的困擾，體細(xì)胞重編程技術(shù)的出現(xiàn)，不僅僅解決了這一困擾科學(xué)界多年的問題，也為再生醫(yī)學(xué)、疾病模型及藥物篩選等研究領(lǐng)域開辟了新的途徑，因此，日本科學(xué)家Shinya Yamanaka 與英國科學(xué)家John Gurdon 共同分享了2012 年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

5. 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs 細(xì)胞)或胚胎干細(xì)胞(ESCs)誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的策略

將iPSCs/ ESCs 擴(kuò)增培養(yǎng)后，注射至免疫缺陷小鼠皮下，8-12 周后可以在體內(nèi)形成畸胎瘤，顯微鏡下可以觀察到畸胎瘤內(nèi)有軟骨島形成，這不僅是鑒定誘導(dǎo)所得的iPS 細(xì)胞是否具有多能性的金標(biāo)準(zhǔn)，也從側(cè)面證明了iPS 細(xì)胞具有形成軟骨的能力。目前，對(duì)于iPSCs/ ESCs 定向向軟骨或軟骨細(xì)胞分化的研究有很多[11-14]，概括起來大致可分為以下四種方法，這四種方法各有優(yōu)劣。(1)將iPS細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以促進(jìn)iPS 細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，但是這種方法得到的軟骨細(xì)胞數(shù)量比較少，完全依賴于共培養(yǎng)體系下原始軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量。(2)讓iPS細(xì)胞先在體外形成擬胚體(Embryoid bodies， EB)后，再選取擬胚體中的中胚層成分進(jìn)行軟骨或軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，這種方法的缺點(diǎn)是其所能得到的可誘導(dǎo)軟骨或軟骨細(xì)胞的中胚層細(xì)胞較少，難以滿足組織工程技術(shù)所需要的細(xì)胞量。(3)將iPS 細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞(Mesenchymal stem cell-like cells，MSC-like cells)誘導(dǎo)分化，再進(jìn)一步將所得到的MSC-like cells 向軟骨或軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，這種方法的缺點(diǎn)在于如何高效獲取能發(fā)揮良好分化功能的MSC-like 細(xì)胞。(4)模擬軟骨細(xì)胞發(fā)育過程，經(jīng)歷原始中內(nèi)胚層、中胚層和軟骨誘導(dǎo)三個(gè)階段，分別在每一階段給予含相應(yīng)的細(xì)胞因子培養(yǎng)基誘導(dǎo)，最終得到SOX-9 表達(dá)陽性的軟骨細(xì)胞[15]。盡管已有上述的眾多實(shí)驗(yàn)證明iPSCs 可以向軟骨或者軟骨細(xì)胞分化，表達(dá)軟骨細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志，但是，迄今為止，還無學(xué)者發(fā)表論文證實(shí)由iPSCs 誘導(dǎo)所得的軟骨細(xì)胞可以生成具備一定機(jī)械性能的軟骨。而于1998 年和2001 年，學(xué)者Johnstone 和Barry[16，17]就曾發(fā)表論文稱通過一定的誘導(dǎo)手段，BMSCs 可以誘導(dǎo)為真正意義上的軟骨。究竟iPSCs 是否可以像BMSCs 一樣，制備出真正意義上的具備一定機(jī)械性能、可承受一定壓力的軟骨組織，就目前的研究而言，還不足以讓我們下結(jié)論，還需要進(jìn)一步的深入研究來證實(shí)。

6. 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)向軟骨細(xì)胞定向分化的主要影響因素

iPSCs 的定向分化是目前的研究難點(diǎn)和熱點(diǎn)。既往的研究多數(shù)集中于血液、神經(jīng)和肝細(xì)胞等的分化，而利用iPSCs 的多分化潛能來進(jìn)行軟骨細(xì)胞定向分化的研究少之又少；但是，隨著組織工程化軟骨技術(shù)的興起，越來越多的學(xué)者開始重視iPSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究。并進(jìn)一步的闡明了iPSCs向軟骨細(xì)胞分化的主要影響因素。細(xì)胞的生長環(huán)境直接影響軟骨細(xì)胞的分化。研究表明，3D 環(huán)境對(duì)于軟骨細(xì)胞的生長更為有利。Hwang NS 等[18，19]將細(xì)胞包被在水凝膠的研究證明了3D 環(huán)境更加適合軟骨形成。諸多生長因子、細(xì)胞因子和分子信號(hào)都直接或間接的參與了軟骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。Toh WS 等[20]研究表明BMP2 能顯著提高軟骨細(xì)胞的分化。在胚胎發(fā)育的過程中，Hargus G 等[21]研究闡明了SOX9 表達(dá)于軟骨前體細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。Ikeda T 等[22]研究提示ES 細(xì)胞敲除SOX9 基因后會(huì)導(dǎo)致分化軟骨細(xì)胞缺陷，而高表達(dá)SOX9 的非軟骨組織可表達(dá)col-Ⅱ；Majumdar MK 等[23]研究表明白介素-1(IL-1)通過降低SOX9 和COL2a 表達(dá)，從而抑制軟骨分化。Derfoul 等[24]通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使鼠胚胎間充質(zhì)系表達(dá)Wnt-3a，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞堿性磷酸酶活性表達(dá)陽性，并且Wnt-3a 可顯著抑制骨唾液蛋白、骨橋蛋白基因的表達(dá)。Runx2 家族[25]主要在骨軟骨形成中，通過維持啟動(dòng)早期軟骨細(xì)胞分化來促進(jìn)軟骨發(fā)生，是軟骨細(xì)胞分化晚期的關(guān)鍵基因。

7. 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的比較

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能、高度增殖和自我更新能力的多潛能干細(xì)胞。20 世紀(jì)六十年代Friedenstein等[26]在骨髓中首次發(fā)現(xiàn)，隨著研究的不斷深入，間充質(zhì)干細(xì)胞還被發(fā)現(xiàn)存在于臍帶血、胎盤、脂肪組織、骨膜、滑膜、肌肉、真皮組織等多種組織中，甚至在外周血[27]和牙周膜[28]中也發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞的存在。MSCs 來源的多樣性，一方面豐富了組織工程種子細(xì)胞的來源，但是另一方面也增加了臨床應(yīng)用的不確定性，不同組織來源的MSCs 在表型上可能不同，表型的不同可能直接關(guān)系到其發(fā)揮相應(yīng)功能的潛力。MSCs 有多種功能，如抑制腫瘤，免疫調(diào)控，造血支持，多向分化潛能等，但是，由于MSC 有限的增殖代數(shù)，如何獲取千萬級(jí)的可用于組織工程的種子細(xì)胞數(shù)量，仍然是目前制約MSC 發(fā)展的最大瓶頸。而相比MSC 而言，iPS細(xì)胞不存在種子細(xì)胞數(shù)量不足的缺點(diǎn)，理論上其具備無限傳代的能力，且目前已有研究表明，IPS 細(xì)胞在一定的條件下，可以向MSC 細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Gruenloh 等[29]報(bào)道來源于人ESCs 的MSCs 細(xì)胞，表現(xiàn)出與BMMSCs 類似的細(xì)胞表型，核型穩(wěn)定，具備三向分化能力，并且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其可以有效治療肢端缺血?jiǎng)游锬Ｐ?；Lian 等[30]報(bào)道他們通過流式技術(shù)篩選出了CD24-CD105+ 細(xì)胞群，再通過單克隆篩選的方法，從這群細(xì)胞群里得出了具備MSC 功能的iPS-MSC 細(xì)胞克隆團(tuán)，且得出的細(xì)胞端粒酶活性比BMSC 相比，要高出100 倍以上。

8. 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究前景

盡管目前對(duì)于iPSCs 細(xì)胞系的建立在技術(shù)上已很成熟，但是重編程依舊是一個(gè)包含大量未知事件的緩慢而低效的過程，具體機(jī)制不明。iPSCs 的出現(xiàn)，讓自體軟骨或軟骨細(xì)胞移植修復(fù)成為可能，但自體移植的過程并非簡單可以完成的，需要大量的工作來完成，不管是時(shí)間上還是人力物力上，都消耗巨大。為了克服這一困難，建立起符合良好質(zhì)量 標(biāo) 準(zhǔn)(Good manufacturing practice， GMP)的iPS 細(xì)胞庫，是解決這一困難的最佳途徑[31]。軟骨組織的結(jié)構(gòu)特異性，局部無血管神經(jīng)的分布，故其免疫原性較低，在一定程度上可以接受同種異體移植而不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥，iPS 細(xì)胞庫將給今后同種異體軟骨移植帶來極大的便利。iPS 細(xì)胞作為理想的種子細(xì)胞，給干細(xì)胞研究帶來了新的方向，同時(shí)也極大的推動(dòng)了多能干細(xì)胞在臨床應(yīng)用方面的發(fā)展。利用iPSCs 可以獲得病人自體來源的多能干細(xì)胞，不再擔(dān)心使用胚胎干細(xì)胞時(shí)所遇到的倫理問題；通過構(gòu)建疾病特異性iPSCs，可以用來研究各種疾病的發(fā)病機(jī)理以及篩選新的藥物；利用iPSCs的多向分化潛能可以獲得大量用于細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞。 目前，已經(jīng)有很多關(guān)于疾病特異性iPSCs 的報(bào)道。例如帕金森癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等神經(jīng)性疾病，地中海貧血癥、鐮刀型貧血癥等血液性疾病，糖原儲(chǔ)積癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、I 型糖尿病等代謝性疾病[32-39]。通過基因工程技術(shù)可以將這些疾病特異性iPSCs 的基因缺陷進(jìn)行修復(fù)，然后用修復(fù)后的iPSCs 向功能細(xì)胞定向分化，即可獲得功能正常的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療[40]。綜上所述，盡管目前對(duì)于iPS 細(xì)胞產(chǎn)生的具體機(jī)制尚不明確，定向軟骨或軟骨細(xì)胞分化的研究還不夠深入，仍有許多問題亟待解決，但是，iPS 細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，無疑給干細(xì)胞的研究，再生醫(yī)學(xué)的研究開辟了新的途徑。

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