干細(xì)胞技術(shù)與牙齒再生的研究進(jìn)展

劉曉，何穎綜述，樸正根審校

（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔系廣東廣州510632）

·綜述·

干細(xì)胞技術(shù)與牙齒再生的研究進(jìn)展

劉曉，何穎綜述，樸正根審校

（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔系廣東廣州510632）

牙齒是一個(gè)復(fù)雜的生物器官，由多種組織組成，包括牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)和牙髓，牙齒脫落是最常見(jiàn)的器官衰竭［1］。牙齒及其支持組織是由上下頜突和額鼻突的外胚層及外胚間葉細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，其發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞與細(xì)胞、上皮與間充質(zhì)的相互作用，細(xì)胞分化，形態(tài)發(fā)生，組織礦化和牙齒的萌出，而牙胚的分化和發(fā)育過(guò)程是依賴于特定牙齒發(fā)生部位的上皮組織及其下方的間充質(zhì)組織相互作用而形成的，故對(duì)于再生的牙齒來(lái)說(shuō)，其發(fā)育至少需要兩種細(xì)胞，即牙源性上皮細(xì)胞及牙源性間充質(zhì)細(xì)胞，而牙齒再生研究的方向多半是尋找這兩種細(xì)胞的替代物。

干細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞，其生物學(xué)特征既具有自我更新的能力，又具有多向分化的潛能，可以在機(jī)體生命過(guò)程中無(wú)限期分裂，并在合適的條件或給予恰當(dāng)?shù)臈l件后，能分化產(chǎn)生多種不同的細(xì)胞類型；根據(jù)干細(xì)胞的不同發(fā)育階段，目前可將其劃分為：①胚胎干細(xì)胞；②成體干細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等。某些干細(xì)胞可定向分化，發(fā)育成熟為一種特定細(xì)胞或限于某種功能的細(xì)胞，如：心肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等；某些干細(xì)胞定向性不強(qiáng)，但具有分化成多種類型細(xì)胞的潛能［2］。干細(xì)胞技術(shù)，又稱為再生醫(yī)療技術(shù)，是指通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、體外培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)、甚至基因修飾等過(guò)程，在體外繁育出全新的、正常的甚至更年輕的細(xì)胞、組織或器官，并最終通過(guò)細(xì)胞組織或器官的移植實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床疾病的治療。本文就幾個(gè)典型的干細(xì)胞在牙齒再生中的應(yīng)用作一綜述，為牙齒再生研究提供新的思路。

1　胚胎干細(xì)胞與牙齒再生

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESc）是早期胚胎或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，它具有一種內(nèi)在的自我更新能力并能分化成各種各樣的功能性組織細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性［3］。無(wú)論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ESc都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。人類ESc是由美國(guó)生物學(xué)家Thomson［4］第一次所分離出來(lái)。ESc是一種多能性細(xì)胞，來(lái)源于三個(gè)胚胎層的衍生物?？紤]到未來(lái)的臨床應(yīng)用，ESc可分化為神經(jīng)元，心肌細(xì)胞和許多其他類型的細(xì)胞［5］。大量的研究證明小鼠的ESc可以分化為心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞［6-10］等。在上皮分化方面，ESc可分化為角膜上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞［11-13］等。人類ESc對(duì)于人類疾病的細(xì)胞治療也有著巨大的潛力，如：糖尿病，神經(jīng)元退化性紊亂等［14］。

ESc在牙齒再生方面的研究早期主要是集中在誘導(dǎo)其形成神經(jīng)嵴樣細(xì)胞，由于其廣泛的潛力，已有成功從人類ESc中產(chǎn)生出神經(jīng)嵴樣細(xì)胞的報(bào)道，神經(jīng)嵴樣細(xì)胞已成為一個(gè)研究干細(xì)胞生物學(xué)和疾病發(fā)展的理想的模型系統(tǒng)［15］。神經(jīng)嵴細(xì)胞是一個(gè)多能的ESc細(xì)胞群，它對(duì)顱面部的各種結(jié)構(gòu)包括牙齒的形成有重要作用，現(xiàn)在已經(jīng)普遍認(rèn)為牙釉質(zhì)是它外胚層的衍生物，而牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體以及其周圍的支持組織是源自神經(jīng)嵴細(xì)胞衍生物的間質(zhì)［16］。故ESc對(duì)于牙齒的形成與再生有著重要的意義。而ESc對(duì)于牙周組織的再生也有重要作用，牙周組織需要牙根表面新的牙骨質(zhì)的形成，新的牙槽骨以及能使兩礦化組織之間進(jìn)行功能連接的牙周韌帶纖維［17-18］。

上皮和間充質(zhì)是牙齒器官再生所需的組分。有研究表明，小鼠的ESc和小鼠骨髓細(xì)胞可以分化為成釉樣細(xì)胞。這些小鼠干細(xì)胞的研究表明，人類ESc可成為牙源性上皮細(xì)胞再生的一個(gè)可行的細(xì)胞來(lái)源。研究的確定因素包括了人牙源性間質(zhì)可以促進(jìn)ESc來(lái)源的上皮細(xì)胞進(jìn)一步分化，并將進(jìn)一步促進(jìn)ESc在牙齒組織再生中的作用［19］。研究者Fang Ning［20］開(kāi)發(fā)了一種有效的培養(yǎng)方式誘導(dǎo)小鼠ESc分化為牙源性上皮細(xì)胞。通過(guò)將小鼠ESc放入無(wú)造釉細(xì)胞血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)分化出牙源性上皮細(xì)胞；并可觀察到將小鼠ESc植入免疫功能不全小鼠中會(huì)顯示出組織再生的能力，形成牙源性上皮樣結(jié)構(gòu)。還有國(guó)內(nèi)學(xué)者Jiang［21］研究通過(guò)在體外將ESc誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)將ESc誘導(dǎo)分化為擬胚體后，再將擬胚體細(xì)胞與牙髓成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，可以促進(jìn)擬胚體細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化。

從理論上講，ESc比ASc更具有分化潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下，即可發(fā)育分化為所有組織器官具有特定功能的細(xì)胞，這一成就將會(huì)給移植治療、藥物的發(fā)現(xiàn)與篩選、基因治療和生物發(fā)育等基礎(chǔ)研究等帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響，打開(kāi)在體外生產(chǎn)人體所有類型可供移植治療的細(xì)胞、組織乃至器官的大門［22］。但是ESc的倫理爭(zhēng)議，在疾病治療中存在的免疫排斥問(wèn)題以及形成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)制約著它的應(yīng)用。

2　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與牙齒再生

隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，早在2006年，日本的兩位科學(xué)家KazutoshiTakahashi和Shinya Yamanaka［23］發(fā)現(xiàn)向小鼠皮膚成纖維細(xì)胞里轉(zhuǎn)入四個(gè)基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）后，這些細(xì)胞能被誘導(dǎo)成為具有ESc特征的細(xì)胞，因其具有多能性，能分化產(chǎn)生體內(nèi)任何類型的細(xì)胞，故稱之為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcell，iPSc）。其具有自我復(fù)制、自我更新和多向分化的能力，現(xiàn)已有研究證實(shí)，iPSc可以向人體內(nèi)三個(gè)胚層的細(xì)胞分化，如外胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞、中胚層分化為心血管和造血細(xì)胞、內(nèi)胚層分化為肝、腎等細(xì)胞。至此，揭開(kāi)了體細(xì)胞重編程的序幕，即從任何一個(gè)胚層發(fā)育分化而來(lái)的細(xì)胞都可重編程成為iPSc，而且不同階段的細(xì)胞重編程的難易程度不同［24］。由于安全、易獲取以及有大量的細(xì)胞來(lái)源，外周血的使用促進(jìn)了iPSc的研究。現(xiàn)在iPSc已經(jīng)被用于細(xì)胞療法，疾病模型和藥物發(fā)現(xiàn)。小鼠iPSc能夠分化成任何類型的細(xì)胞，甚至具有種系傳播的能力［25］。這一技術(shù)是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，它回避了ESc的倫理爭(zhēng)議，使干細(xì)胞向臨床應(yīng)用又邁進(jìn)了一大步。

隨著iPSc研究在醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的興起和發(fā)展［26-28］，2009年以來(lái)口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也開(kāi)始關(guān)注iPSc。現(xiàn)在把成體牙源細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSc的技術(shù)相對(duì)成熟，Oda等［29］從拔牙后被丟棄的智齒中得到間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄OCT3/4，SOX2，KLF4這三個(gè)基因而獲得了iPSc，在不使用原癌基因c-Myc基因的情況下，其產(chǎn)生的效率高于皮膚的成纖維細(xì)胞，使得這一研究在獲得iPSc上又有了新的突破。另外，Xing Yan等［30］把牙齒干細(xì)胞，如：脫落乳牙干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核重組而誘導(dǎo)成iPSc，因牙髓干細(xì)胞和脫落乳牙干細(xì)胞能低水平地表達(dá)與胚胎干細(xì)胞有關(guān)的基因，故和誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞相比，顯示出更高的效率。人牙齦纖維細(xì)胞和牙周膜纖維細(xì)胞衍生出的iPSc與人ESc表現(xiàn)出相似的特性，這些結(jié)果說(shuō)明牙齦纖維細(xì)胞、牙周膜纖維細(xì)胞［31］、口腔黏膜纖維細(xì)胞［32］也可被誘導(dǎo)成iPSc。許多類型的細(xì)胞已經(jīng)成功地在鼠身上完成了向iPSc的重組；然而重組人類細(xì)胞卻變得更加困難。

近年來(lái)，iPS牙向分化及參與牙齒再生的研究成果開(kāi)始被相繼報(bào)道，iPSc在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為神經(jīng)嵴樣細(xì)胞［33］，它能表達(dá)諸如STRO-1、Lhx6和Msx1等牙源間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志，通過(guò)與鼠牙源性上皮的相互作用神經(jīng)嵴樣細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為牙源性間充質(zhì)細(xì)胞（主要是成牙本質(zhì)前體細(xì)胞），從而顯現(xiàn)出iPSc在牙齒再生方面的潛能，但是相對(duì)于ESc，iPSc存在著分化效率低的問(wèn)題。通過(guò)iPSc與牙源性上皮細(xì)胞的相互作用，可誘導(dǎo)其分化為表達(dá)p63、CK14和成釉蛋白的上皮［34］，這是第一次報(bào)道iPSc通過(guò)與牙源性上皮交互作用而分化為成釉細(xì)胞。但是，目前這些研究成果仍停留在相關(guān)標(biāo)記分子的檢測(cè)階段，未真正獲得再生牙。然而，Cai［35］課題組最新的研究結(jié)果顯示，尿液來(lái)源的iPSc經(jīng)過(guò)BMP-4、RA誘導(dǎo)后能形成表達(dá)p63的上皮組織，將上皮組織與鼠的間充質(zhì)重組形成的重組牙胚移植入腎包膜下后能形成完整牙齒，這是首例運(yùn)用iPSc產(chǎn)生再生牙。雖然在文章中提及有牙齒產(chǎn)生的概率問(wèn)題，但iPSc在牙再生中的應(yīng)用已開(kāi)始嶄露頭角，其應(yīng)用前景不容小覷。

iPSc的來(lái)源更方便、更豐富，可以通過(guò)有限的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染并直接誘導(dǎo)胎兒、新生兒和成年動(dòng)物或人的體細(xì)胞來(lái)獲取多能性干細(xì)胞。其次，iPSc的產(chǎn)生再也不需要早期胚胎或者其他配子的參與，克服了使用傳統(tǒng)方法的倫理問(wèn)題，可見(jiàn)iPSc必然成為未來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)的研究熱點(diǎn)［36］。由于iPSc具有與ESc相類似的特性和功能，其成功地繞開(kāi)了免疫排斥問(wèn)題和倫理道德問(wèn)題的困擾，是再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞，也可作為臨床藥物篩選細(xì)胞模型和人類疾病治療細(xì)胞模型［37］。

3　成體干細(xì)胞與牙齒再生

成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASc）指存在于發(fā)育成熟機(jī)體組織中的具有高度自我更新和分化潛能的未分化細(xì)胞，ASc具有自我更新，不斷增殖和分化轉(zhuǎn)移的能力，它有廣泛的來(lái)源，不涉及倫理問(wèn)題。ASc在組織工程中將起到非常重要的作用，如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的修復(fù)，重建以及神經(jīng)組織的再生［38］。目前已在幾乎所有機(jī)體組織中發(fā)現(xiàn)ASc的存在，其特有的生物學(xué)特性及潛在的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值，使之成為近年來(lái)生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最受關(guān)注的熱點(diǎn)課題之一。ASc定位在特定的器官可以分化成巨噬細(xì)胞和骨細(xì)胞等功能性實(shí)體，造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞是兩種最重要的ASc，它們有能力去通過(guò)血液循環(huán)、遷移到損傷部位以及增強(qiáng)再生的過(guò)程［39］。

ASc與牙髓、牙齒的再生，Ishizeki［40］將完整分離的鼠牙牙髓移植于脾臟，發(fā)現(xiàn)40d后有類似于天然的管狀牙本質(zhì)形成，尚有骨性牙本質(zhì)的形成；而Yamada［41］將25d鼠牙胚體外連續(xù)培養(yǎng)10d，結(jié)果形成了牙本質(zhì)和釉質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)。ASc與牙周組織再生，不少學(xué)者認(rèn)為牙周膜是一個(gè)自我更新的系統(tǒng)，存在原始的能產(chǎn)生不同表型的干細(xì)胞或稱為牙周膜前體細(xì)胞，這種干細(xì)胞就是牙周膜干細(xì)胞，它具有不定向分化潛能，在不同的生長(zhǎng)因子微環(huán)境條件下，可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞及成骨細(xì)胞，分別形成牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨，是牙周組織工程化理想的種子細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞［42］（dental pucp stem cells，DPSCs）是一種成體干細(xì)胞，DPSCs重要的特征之一是一定條件下能形成牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體，這將為其應(yīng)用于組織工程中重建牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體展示了巨大的優(yōu)越性和可行性，也為其在牙髓生理、病理、牙髓病生物治療方面的研究提供了重要的應(yīng)用價(jià)值。

ASc由于具有較長(zhǎng)期的自我更新能力，在一定條件下，可分化為不同類型的細(xì)胞，并形成相應(yīng)的組織，被認(rèn)為是組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最有價(jià)值的種子細(xì)胞。不僅口腔來(lái)源的ASc作為組織工程的種子細(xì)胞，成功構(gòu)建了牙本質(zhì)、牙髓、牙周膜、牙骨質(zhì)再生甚至全牙；而且其他組織起源的ASc，如：造血干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞等也可能在口腔頜面部血管、骨、皮膚、神經(jīng)、肌肉等組織的損傷與修復(fù)治療中發(fā)揮重要作用。早在2005年，Modino和Sharpe［43］的實(shí)驗(yàn)就已表明，利用非牙源性的ASc是可以誘導(dǎo)牙的發(fā)生以及形成牙齒的，同時(shí)也指出可將發(fā)育中的牙胚成功植入到患者的牙齦中。目前對(duì)ASc研究的深入，尤其是ASc用于牙本質(zhì)、牙髓、骨、軟骨組織的再生，將為牙再生奠定可靠的基礎(chǔ)。

ASc的優(yōu)點(diǎn)，獲取相對(duì)容易，源于患者自身的ASc在應(yīng)用時(shí)不存在組織相容性的問(wèn)題，避免了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑。理論上，ASc致瘤風(fēng)險(xiǎn)很低，而且所受倫理學(xué)爭(zhēng)議較少，ASc還具有多向分化潛能。因此，人們對(duì)ASc在臨床治療中的應(yīng)用寄予很高的期望［44］。

4　展望

目前，干細(xì)胞的研究幾乎涵蓋了基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。這一方面有助于我們認(rèn)識(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和器官形成等基本生命規(guī)律，另一方面，也為治療某些疾病開(kāi)辟了一條新的途徑。隨著口腔醫(yī)學(xué)日新月異的發(fā)展，干細(xì)胞在口腔方面的應(yīng)用研究正在迅速深入開(kāi)展?，F(xiàn)在研究最多的就是上述的ESc，iPSc和ASc。

ESc具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性，對(duì)于牙齒的形成與再生有著重要的意義。但由于ESc的獲得和研究涉及到復(fù)雜的倫理問(wèn)題，它的相關(guān)研究受到了極大的限制。ASc是具有高度自我更新和分化潛能的未分化細(xì)胞，在誘導(dǎo)牙的發(fā)生以及形成牙也有著舉足輕重的作用。ASc因離成熟細(xì)胞近、來(lái)源廣泛、可塑性強(qiáng)、無(wú)免疫排斥等優(yōu)勢(shì)，已展示了誘人的臨床應(yīng)用前景。ASc的研究進(jìn)展也必將為口腔基礎(chǔ)和臨床研究打開(kāi)新的突破口。

iPSc不僅在細(xì)胞形態(tài)、表面抗原、基因表達(dá)、增殖及分化潛能方面類似于ESc，而且，擺脫了圍繞人類ESc使用問(wèn)題的政治和倫理爭(zhēng)論，避免了患者異體干細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。iPSc僅僅出現(xiàn)了兩年，便已在提高效率和應(yīng)用到各種模式生物上取得了很大進(jìn)展［45］。而且，Cai課題組最新的研究結(jié)果顯示，尿液來(lái)源的iPSc經(jīng)過(guò)BMP-4、RA誘導(dǎo)后能形成表達(dá)p63的上皮組織，將上皮組織與鼠的間充質(zhì)重組形成的重組牙胚移植入腎包膜下后能形成完整牙齒，這是首例運(yùn)用iPSc產(chǎn)生再生牙。這說(shuō)明iPSc在牙再生中的應(yīng)用已開(kāi)始嶄露頭角，其應(yīng)用前景不容小覷，其發(fā)展前景已逐見(jiàn)曙光。

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The research of stem cell technology in tooth regeneration

2015-04-07

2015-05-11

編輯/李陽(yáng)利

注：劉曉、何穎均為暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)在讀碩士

中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題資助（編號(hào)：KLRB201217）

樸正根，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師；E-mail：pzg430@126.com