腦缺血預(yù)適應(yīng)標(biāo)志物的評(píng)估

蘇芳，朱雨嵐，郭安臣，王擁軍1，，王群1，

腦缺血是世界范圍內(nèi)首要的致殘及致死原因之一[1]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)大量神經(jīng)保護(hù)因子有效，但臨床試驗(yàn)均無(wú)效。因此，人們致力于探索腦缺血的新的治療策略，其中缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IPC）受到廣泛的關(guān)注。腦缺血預(yù)適應(yīng)是對(duì)抗缺血性腦血管疾病的細(xì)胞保護(hù)策略，它通過(guò)短暫的缺血誘導(dǎo)固有的防御系統(tǒng)，引起對(duì)隨后的嚴(yán)重缺血的耐受。例如，短暫阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈可保護(hù)隨后的長(zhǎng)時(shí)缺血并縮小梗死體積；遠(yuǎn)程IPC可保護(hù)遠(yuǎn)隔器官的更嚴(yán)重的缺血[2]。發(fā)現(xiàn)可能影響IPC的效應(yīng)器及因子是IPC發(fā)展為臨床試驗(yàn)的非常理想的目標(biāo)。確定適合的標(biāo)志物以表明預(yù)適應(yīng)反應(yīng)的誘發(fā)是轉(zhuǎn)化研究的重點(diǎn)。因此，全面系統(tǒng)地研究缺血耐受的機(jī)體特點(diǎn)，從而確定發(fā)展適合的標(biāo)志物，以表明神經(jīng)保護(hù)治療成功轉(zhuǎn)化，具有重要的理論及臨床意義。本文將對(duì)IPC的機(jī)制及可能的生物學(xué)標(biāo)志物予以綜述。

1 缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制

IPC是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，它誘導(dǎo)的缺血耐受存在于包括人、大鼠、小鼠、兔和豬等多種生物以及腦、肝臟、心臟、腎臟和脊髓等多種器官，這也證明了預(yù)適應(yīng)反應(yīng)的普遍性[3-6]。眾所周知，IPC激活了廣泛的不同的保護(hù)機(jī)制并且可抑制潛在的有害通路[7-8]。如IPC可以激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs），而TLR預(yù)處理可通過(guò)減少循環(huán)血中白細(xì)胞的活化、淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的黏附、中性粒細(xì)胞的滲出、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活等減輕局灶腦缺血后的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)作用[9]。其他研究在大鼠腦、心臟等靶組織發(fā)現(xiàn)了多種反應(yīng)，例如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）的表達(dá)，腺苷受體、一氧化氮代謝的上調(diào)等，并且將這些反應(yīng)與組織保護(hù)關(guān)聯(lián)[10-11]?？傊?，IPC誘導(dǎo)的保護(hù)作用基于以下幾方面：細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)的改變[12]；線粒體代謝的調(diào)節(jié)[4]；防護(hù)興奮性毒性損傷及缺氧/缺血去極化[13]；通過(guò)離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改善容量以保護(hù)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)及pH穩(wěn)態(tài)[14]；抑制凋亡機(jī)制[15]；激活脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）修復(fù)及自我修復(fù)[16]；抑制炎癥反應(yīng)[17]；調(diào)節(jié)缺血再灌注階段的血流及血管重塑[18]。

IPC可以分為發(fā)生于亞致死性損傷后數(shù)分鐘并持續(xù)幾小時(shí)的早期階段及發(fā)生在24～48 h后持續(xù)數(shù)天至數(shù)周的晚期階段[19]，這兩階段有不同的保護(hù)機(jī)制。預(yù)適應(yīng)反應(yīng)開(kāi)始階段包括許多觸發(fā)機(jī)制，如細(xì)胞因子[20]、腺苷受體[21]、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）-敏感鉀通道[22]及氧化應(yīng)激等。IPC后早期再灌注，神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)通過(guò)蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾快速啟動(dòng)，晚期階段依賴(lài)于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的從頭合成[19]，而晚發(fā)階段新合成的蛋白質(zhì)有可能成為神經(jīng)保護(hù)治療成功的標(biāo)志物。

這些臨床前研究，明確了預(yù)適應(yīng)反應(yīng)的重要通路，但它們很難作為預(yù)適應(yīng)反應(yīng)的標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈兇蠖嘈枰苯佑袆?chuàng)的組織檢測(cè)，而這些很難在人腦、心臟等器官實(shí)現(xiàn)，但它們?yōu)榕R床標(biāo)志物的進(jìn)一步發(fā)展和試驗(yàn)指明了方向并提供了理論依據(jù)。

2 臨床缺血預(yù)適應(yīng)模型

大部分在體IPC模型是嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，通常是有創(chuàng)的，很難轉(zhuǎn)化成臨床應(yīng)用。然而，一種IPC改進(jìn)的形式——遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)（remote ischemic preconditioning，RIPC）被證明具有高度的轉(zhuǎn)化價(jià)值[23]。RIPC包括周期性暫時(shí)阻斷和再恢復(fù)遠(yuǎn)離細(xì)胞保護(hù)靶器官的肢體血流。在這一區(qū)域反復(fù)的周期性暫時(shí)缺血可以觸發(fā)可溶性保護(hù)因子釋放入血液，并分布到靶器官發(fā)揮保護(hù)作用[24]。如，臨床試驗(yàn)使用血壓袖帶暫時(shí)阻斷和恢復(fù)患者上肢或大腿血流，因此稱(chēng)為RIPC模型之一[25]。RIPC處理后的冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者，射血分?jǐn)?shù)、移植物通暢及心電圖參數(shù)均有所改善[26]。研究證實(shí)RIPC在嚴(yán)重蛛網(wǎng)膜下腔出血患者中也是安全且耐受的[6]，因此RIPC可能是一種易行的預(yù)防性治療方法。RIPC確切的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。

3 臨床缺血預(yù)適應(yīng)生物標(biāo)志物的評(píng)估

缺血耐受狀態(tài)生物標(biāo)志物的發(fā)展具有重大的臨床和科學(xué)意義，基于以往實(shí)驗(yàn)確定的信號(hào)通路及機(jī)制，人們已經(jīng)開(kāi)始評(píng)估人類(lèi)對(duì)預(yù)處理的生物反應(yīng)。而卒中時(shí)預(yù)適應(yīng)反應(yīng)可能標(biāo)志物的臨床研究相對(duì)較少。鑒于預(yù)適應(yīng)眾多的生物學(xué)作用，識(shí)別血清標(biāo)志物、確定缺血耐受狀態(tài)的存在似乎是可能的。血清標(biāo)志物易于檢測(cè)，可重復(fù)，并且可商業(yè)化，有較好的臨床應(yīng)用前景，一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)。迄今為止大多數(shù)的臨床研究通過(guò)研究血清止血、內(nèi)皮細(xì)胞功能、炎癥反應(yīng)及影像學(xué)標(biāo)志等來(lái)評(píng)估人類(lèi)對(duì)預(yù)適應(yīng)的反應(yīng)。

3.1 止血標(biāo)志物 研究表明預(yù)適應(yīng)對(duì)涉及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的止血、纖溶支持蛋白的基因表達(dá)有廣泛的作用，這些蛋白可作為預(yù)適應(yīng)反應(yīng)潛在的標(biāo)志物[27]。在健康志愿者蛋白質(zhì)組研究中，Hepponstall等[28]對(duì)5位健康志愿者上肢進(jìn)行4次（每次5 min）循環(huán)的缺血預(yù)處理，涉及止血、免疫反應(yīng)、抗炎、氧化應(yīng)激抑制、內(nèi)皮細(xì)胞活化等多種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了改變。例如，RIPC組纖維蛋白原β（fibrinogen beta，F(xiàn)gβ）下調(diào)，而Fgβ是止血蛋白，可以促進(jìn)缺血再灌注時(shí)血小板的黏附，它的下調(diào)可能與RIPC的保護(hù)作用有關(guān)，因此Fgβ可能作為IPC潛在的標(biāo)志物。Pedersen等[29]對(duì)22例健康志愿者進(jìn)行上肢3次（每次5 min）循環(huán)缺血預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)處理不影響血清纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）和tPA抑制劑抗原及活性。但是該研究給予預(yù)處理刺激及進(jìn)行血清分析的時(shí)間間隔相對(duì)較短（缺血預(yù)處理30 min內(nèi)給予評(píng)估），如延長(zhǎng)分析時(shí)間，預(yù)適應(yīng)對(duì)這些蛋白的延遲作用仍可能存在。還有研究表明，RIPC可抑制人缺血再灌注損傷相關(guān)的血小板的活化[30]。Oberkofler等[31]在鼠的研究中發(fā)現(xiàn)血小板-血清素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10/基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinste，MMP）-8軸介導(dǎo)了RIPC的保護(hù)作用。而血小板活化的標(biāo)記是否能可靠地衡量預(yù)適應(yīng)反應(yīng)尚需進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

3.2 內(nèi)皮及血管活性因子 Park等[32]對(duì)沙土鼠的研究發(fā)現(xiàn)，IPC可顯著增強(qiáng)缺血再灌注后CA1區(qū)錐體細(xì)胞VEGF的誘導(dǎo)及其受體的免疫活性，該研究提示VEGF的表達(dá)增加可能對(duì)于短暫性缺血性損傷細(xì)胞的存活是必需的。Kimura等[33]評(píng)估了IPC對(duì)血管活性和內(nèi)皮因子的影響，健康志愿者接受為期1個(gè)月，每天4次（每次5 min）重復(fù)的前臂缺血預(yù)適應(yīng)，發(fā)現(xiàn)IPC可引起血漿VEGF水平及內(nèi)皮祖細(xì)胞升高，提示重復(fù)的IPC刺激可增強(qiáng)內(nèi)皮依賴(lài)的血管舒張，IPC是周?chē)鼙Ｗo(hù)的一個(gè)簡(jiǎn)單、安全易行的治療技術(shù)，而血漿VEGF的升高可作為預(yù)適應(yīng)反應(yīng)發(fā)生的潛在的標(biāo)志物。還有學(xué)者提出了一些血管活性物質(zhì)例如一氧化氮的活化、緩激肽等介導(dǎo)了IPC反應(yīng)，但由于這些物質(zhì)難于檢測(cè)，目前少有關(guān)于預(yù)適應(yīng)如何影響這些物質(zhì)水平的臨床研究。

3.3 炎癥標(biāo)志物 大部分評(píng)估人類(lèi)預(yù)適應(yīng)反應(yīng)的臨床工作僅涉及免疫和炎癥系統(tǒng)。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）過(guò)表達(dá)與腦梗死前短暫缺血中實(shí)驗(yàn)性缺血耐受相關(guān)。Castillo等[34]檢測(cè)了283例腦梗死患者癥狀出現(xiàn)后24 h內(nèi)血漿TNF-α及IL-6的濃度。其中卒中前72 h內(nèi)短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）的患者38例，腦梗死的體積及預(yù)后（Barthel指數(shù)）均顯著低于無(wú)前驅(qū)TIA的患者。有前驅(qū)TIA的患者，血漿TNF-α升高、IL-6降低。當(dāng)TNF-α高于30 pg/ml，IL-6低于30 pg/ml，認(rèn)為一個(gè)新的變量TNF-α/IL-6指數(shù)為陽(yáng)性，陽(yáng)性TNF-α/IL-6指數(shù)存在于92%的腦梗死前患有TIA患者，而腦梗死前無(wú)TIA的患者中僅1%。TNF-α/IL-6指數(shù)增高與腦梗死預(yù)后的改善相關(guān)。Saxena等[35]對(duì)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者術(shù)前上肢缺血預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以下調(diào)中性粒細(xì)胞激肽B1和B2受體的表達(dá)，但血漿C反應(yīng)蛋白無(wú)明顯變化。目前少有臨床試驗(yàn)檢測(cè)腦缺血預(yù)處理中C反應(yīng)蛋白等的變化，有待進(jìn)一步的研究。

3.4 其他血清標(biāo)志物 鈣連接蛋白B（S100 calcium binding protein B，S100B）是評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷（腦外傷、腦梗死、脊髓疾病等）嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物之一，也是較早被研究的急性腦梗死的標(biāo)志物之一。主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，是腦內(nèi)特異蛋白，生物學(xué)功能包括調(diào)鈣作用、細(xì)胞代謝、抑制磷酸化等。缺血性卒中發(fā)生后血清S100B蛋白濃度增加，且與腦梗死體積呈正相關(guān)[36]。有研究表明，脊髓型頸椎病患者頸椎減壓術(shù)前給予上肢缺血預(yù)處理，可降低外周血S100B水平，患者預(yù)后較好[37]。關(guān)于腦缺血預(yù)適應(yīng)中S100B的變化，其是否能夠反映缺血耐受狀態(tài)的發(fā)生、是否有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系少有報(bào)道，尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)評(píng)估其是否可作為IPC的敏感、特異的標(biāo)志物。

微小RNA（microRNA，miRNA），是生物體內(nèi)具有重要調(diào)控作用的非編碼小RNA，在許多病理生理?xiàng)l件下，表達(dá)發(fā)生改變。缺血耐受需要新蛋白質(zhì)的合成，引起大腦對(duì)隨后的缺血反應(yīng)的基因重組，miRNA通過(guò)直接作用于信使RNA（messenger ribonucleic acid，mRNA）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)。Lusardi等[38]研究表明IPC調(diào)節(jié)大鼠大腦皮質(zhì)miRNA表達(dá)，提示miRNA作為IPC誘導(dǎo)的缺血耐受的效應(yīng)器。目前關(guān)于人類(lèi)IPC誘導(dǎo)的缺血耐受狀態(tài)下的miRNA表達(dá)的變化研究較少，由于血液中miRNA易被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）降解，臨床采集標(biāo)本需嚴(yán)格注意，且RNA提取檢測(cè)過(guò)程需時(shí)較長(zhǎng)、費(fèi)用過(guò)高，這些特點(diǎn)限制了其發(fā)展，miRNA是否能作為IPC的標(biāo)志物，尚需進(jìn)一步研究探索。

3.5 影像學(xué)標(biāo)志物 除血清標(biāo)志物外，還可通過(guò)血流、灌注成像及血管舒縮測(cè)試、腦電圖等來(lái)評(píng)估IPC反應(yīng)。IPC的重要生理作用包括增加靶器官的血流。在局灶腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，預(yù)處理增加缺血半暗帶區(qū)的腦血流。Vlasov等[39]通過(guò)高頻多普勒超聲儀探測(cè)缺血預(yù)處理的缺血再灌注大鼠的腦血流量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期和晚期預(yù)處理可增加大鼠腦缺血后的腦血流量。數(shù)項(xiàng)臨床研究評(píng)估了IPC的血流改變，Meng等[40]納入68例癥狀性顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄患者進(jìn)行研究，所有患者接受標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)療管理，其中38例接受連續(xù)300 d，每天2次5個(gè)循環(huán)反復(fù)雙上肢缺血預(yù)處理，單電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（single photon emission-computed tomography，SPECT）及經(jīng)顱多普勒檢查發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較預(yù)處理患者腦灌注及血流增加，300 d時(shí)對(duì)照組卒中復(fù)發(fā)率為26.7%，而預(yù)處理組僅為7.9%。Jensen及其團(tuán)隊(duì)研究了與臨床非常相關(guān)的豬深低溫停循環(huán)模型中RIPC的作用，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)驟停前1 h給予后肢4次（每次5 min）循環(huán)的缺血-再灌注，引起腦乳酸降低、腦電圖快速恢復(fù)及行為學(xué)評(píng)分的改善[41]。Gonzalez等[42]最近報(bào)道了遠(yuǎn)程處理對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血患者發(fā)病后2周血管痙攣高峰期血流動(dòng)力學(xué)及腦代謝的作用，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后2～12 d對(duì)患者進(jìn)行3～4周期的下肢RIPC，每周期4次（每次5 min）循環(huán)的缺血-再灌注，發(fā)現(xiàn)RIPC可引起短暫的血管舒張，改善了患者的腦血流動(dòng)力學(xué)（經(jīng)顱多普勒），降低乳酸/丙酮酸的比例（微量透析）以及丙三醇，改善腦代謝，提示缺血保護(hù)及細(xì)胞膜保護(hù)作用。這將打開(kāi)在因臨床目的需要進(jìn)行有創(chuàng)監(jiān)測(cè)的重癥患者中仔細(xì)監(jiān)測(cè)對(duì)預(yù)適應(yīng)的代謝反應(yīng)的可能。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)代表IPC誘導(dǎo)的缺血耐受狀態(tài)的標(biāo)志物具有較高的臨床意義及科學(xué)價(jià)值。目前已有大量的研究確定了預(yù)適應(yīng)反應(yīng)的信號(hào)通路，其中一些因子已被選擇性用于生物標(biāo)志物發(fā)展的臨床研究。理想的標(biāo)志物不僅需要有較高的敏感性、特異性，易于獲得，還應(yīng)該能夠體現(xiàn)出對(duì)刺激的早期反應(yīng)，體現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，與保護(hù)機(jī)制相聯(lián)系。尋找合適的生物標(biāo)志物以精確衡量IPC反應(yīng)方面仍有許多挑戰(zhàn)，識(shí)別內(nèi)源性缺血耐受狀態(tài)可顯著促進(jìn)血管疾病方面細(xì)胞保護(hù)領(lǐng)域的發(fā)展。然而考慮到這一現(xiàn)象的復(fù)雜性，未來(lái)尚需更多這類(lèi)的臨床研究，以發(fā)現(xiàn)更多的標(biāo)志物或標(biāo)志物的組合。

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【點(diǎn)睛】

IPC是對(duì)抗缺血性腦血管病的細(xì)胞保護(hù)策略，確定適合的標(biāo)志物以表明神經(jīng)保護(hù)治療成功轉(zhuǎn)化具有重要的意義。