新型CDK抑制劑聯合ZD55-MnSOD溶瘤腺病毒體外抑制人結腸癌細胞增殖的研究

韓劍翠, 馬步云, 吳程雨, 王毅剛, 王世兵,b

(浙江理工大學, a. 新元醫(yī)學與生物技術研究所; b. 生命科學學院科研實驗中心, 杭州 310018)

新型CDK抑制劑聯合ZD55-MnSOD溶瘤腺病毒體外抑制人結腸癌細胞增殖的研究

韓劍翠a, 馬步云a, 吳程雨a, 王毅剛a, 王世兵a,b

(浙江理工大學, a. 新元醫(yī)學與生物技術研究所; b. 生命科學學院科研實驗中心, 杭州 310018)

探究攜帶MnSOD的溶瘤腺病毒Ad-E1B55Kd-MnSOD(ZD55-MnSOD)聯合小分子藥物新型CDK抑制劑SNS-032對人結腸癌細胞株SW620、HCT116、HT-29生長的體外抑制效果,通過溶瘤病毒與藥物聯合,以期尋求較好的抗癌作用。實驗采用MTT法檢測5 MOI的ZD55-MnSOD與不同劑量的SNS-032(0、20、40、80、160 ng/mL)聯合處理人結腸癌細胞株,發(fā)現病毒與藥物聯合處理有促進腫瘤細胞凋亡的作用。ZD55-MnSOD(5 MOI)與SNS-032(80 ng/mL)聯合處理SW620、HT-29細胞,發(fā)現聯合作用具有很大程度上的時間依賴性,Hoechst33342染色法和流式細胞儀檢測細胞凋亡也顯示ZD55-MnSOD與SNS-032聯合處理組的細胞凋亡現象比二者單獨使用均具有顯著差異。該研究初步證實了ZD55-MnSOD與SNS-032聯合具有互補作用,能有效地在體外抑制人結腸癌細胞的增殖。

溶瘤腺病毒; SNS-032; 結腸癌; 抗癌作用

0 引 言

ZD55病毒是腫瘤特異性增殖型病毒,ZD55溶瘤病毒它缺少在正常細胞中復制所必需的基因,因此它可以特異性地在腫瘤細胞中復制,然而在正常細胞中卻不復制,由此達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。目前,關于溶瘤腺病毒的研究迅速發(fā)展,可以通過改造啟動子或者刪除非必須基因來達到較好的靶向效果,也有人用溶瘤腺病毒作為載體攜帶抗體或RNA治療癌癥[1-2]。中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所的劉新垣院士在2001年首次正式提出了癌癥的靶向基因-病毒治療(Targeting Gene-Virotherapy)的概念[3-4],基于此概念,本實驗采用ZD55溶瘤腺病毒,因為它能夠滿足腫瘤基因-病毒治療的兩個需要元素:具有靶向性和有可插入外源基因的位點,這為我們進一步開展腫瘤的靶向基因-病毒治療提供了一個理想的平臺。本實驗采用的是錳超氧化物歧化酶基因(manganese superoxide dismutase, MnSOD),它是一種新型腫瘤抑制基因[5],屬于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)家族。SOD家族是將超氧陰離子轉化為過氧化氫的抗氧化酶,可以保護細胞免受過氧化氫損傷,是機體內的一系列抗氧化防御系統(tǒng)。MnSOD它作為細胞內重要的抗氧化酶,不但可以清除細胞內的活性氧(reactive oxygen species, ROS),從而減少失衡或高濃度的ROS的產生對細胞產生一系列的損傷,對蛋白和核酸的損傷所導致的細胞的變異包括細胞的癌變和細胞的死亡,進而防止細胞癌變[6]。實驗證實,MnSOD基因具有防止正常細胞轉化為腫瘤細胞的功能,并且可以抑制腫瘤細胞的快速生長和促使腫瘤細胞的凋亡,MnSOD基因在治療人結腸癌方面具有很好的抗腫瘤效果[7-10]。然而,ZD55-MnSOD又有一定的局限性,因為要達到一定的治療效果就需要增加病毒的使用劑量,但是由于腺病毒它本身會對細胞產生一定的傷害,所以高的病毒劑量會增加治療的風險。要實現使用很少的病毒劑量又要達到很好的治療效果,筆者認為可否將病毒與新型小分子藥物進行聯合治療。研究發(fā)現其與某些抗腫瘤藥物的機制很不相同,二者有可能存在協同性,將二者進行聯合作用有可能進一步有助于腫瘤方面的研究。

SNS-032(也稱為BMS-387032)是一種新型CDK抑制劑,它可以有效地選擇性抑制CDK2、CDK7、CDK9[11-17]。對于SNS-032的研究已有很多報道,它的抗腫瘤效果在多種細胞中都有很好的作用,如結腸癌[18]、乳腺癌[19]、肺癌[12]。該藥已進入臨床一期實驗階段[16,20],無論是作用于實體瘤還是惡性膠質瘤細胞,甚至是腫瘤干細胞都都顯示出很好的抗腫瘤效果[21],并且與一般的抗腫瘤藥物相比,其具有更高的選擇性,并且作用于實體瘤時毒性很弱,較低的藥物劑量便可達到很好的抗腫瘤效果[14,20,22]。然而此藥物與病毒聯合治療的效果尚不清楚,本實驗研究溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD與小分子藥物SNS-032聯合抑制人結腸癌細胞的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑

腺病毒ZD55-MnSOD由本實驗室構建完成。SNS-032購自SELLECK公司。細胞培養(yǎng)用DMEM及胎牛血清購自GIBCO公司。

1.1.2 人結腸癌細胞株及培養(yǎng)

人結腸癌細胞株HCT116、HT-29、SW620均為本實驗室保存。細胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,37℃,5% CO2條件下恒溫培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞存活率

將對數期生長的腫瘤細胞按每孔5 000個細胞植入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入培養(yǎng)液的體積為100 μL,待細胞貼壁后,加入相應的病毒與藥物,體積為20 μL,37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至指定的時間,每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT。37℃,5% CO2培養(yǎng)4 h后,每孔加入150 μL DMSO,劇烈震蕩10 min,在酶標儀上測定490 nm波長處的吸光值。實驗中設不加細胞的空白對照孔。按以下公式計算腫瘤細胞的存活率:

腫瘤細胞存活率=(處理組OD值—空白組OD值)/(對照組OD值—空白組OD值)×100%。

1.2.2 Western blot檢測溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD 目的基因的表達

將5×105個腫瘤細胞鋪于6孔板,每孔加入培養(yǎng)液的體積為1.6 mL,待細胞貼壁后,按照要求分別加入5 MOI的病毒、終濃度為80 ng/mL的SNS-032及加入5 MOI的病毒聯合80 ng/mL的SNS-032各400 μL,以不加病毒的細胞作為對照,在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用4℃預冷的PBS洗板兩次,每孔加入100 μL裂解液,冰上充分裂解15 min后,收入離心管,100℃變性10 min,12 000 r/min,5 min。將上清分裝于-20℃?zhèn)溆?用時直接溶解上樣。將定量蛋白以每孔加入10 μg總蛋白樣加入SDS-PAGE電泳,電泳結束后按半干轉膜法轉膜(PVDF膜),5%的脫脂奶粉中封閉2 h,一抗孵育,按抗體說明書上的最佳稀釋濃度稀釋加一抗(1∶1 000稀釋),室溫下于搖床孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加入稀釋好的熒光二抗(1∶15 000稀釋),室溫下搖床孵育45～60 min,TBST洗膜3次,每次10 min,用LI-COR掃膜儀掃膜,紅外激光成像系統(tǒng)對待測蛋白進行分析。

1.2.3 Hoechst33342染色檢測細胞的凋亡

將對數期的腫瘤細胞按5 000個/孔植入96孔培養(yǎng)板,每孔加入培養(yǎng)液的體積為100 μL,在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁后,用不同濃度的藥物處理HCT116細胞,36 h后,用PBS洗細胞兩次,加入濃度為1 mg/mL的Hoechst33342體積為1 μL,使Hoechst33342的終濃度在0.5～10 μg/mL之間,繼續(xù)在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min,然后在熒光顯微鏡下觀察細胞核的變化并拍照。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞的凋亡

接種5×105個腫瘤細胞鋪于6孔板,每孔加入培養(yǎng)液的體積為1.6 mL,待細胞貼壁后,按照要求分別加入5 MOI的病毒、終濃度為80 ng/mL的SNS-032及加入5 MOI的病毒聯合80 ng/mL的SNS-032各400 μL,以不加病毒的細胞作為對照,在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用PBS洗細胞兩次,收集細胞,參照AnnexinV/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作說明,于流式細胞儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用Excel 2003分析數據,用GraphPad5.0作圖,結果采用t檢驗,NS表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,用“*”表示,P<0.01表示差異極顯著,用“**”表示。

2 結 果

2.1 單獨使用SNS-032對結腸癌細胞的存活率的 影響

通過MTT法檢測不同劑量的SNS-032對不同結腸癌細胞在不同時間的殺傷作用,結果如圖1所示。圖1顯示SNS-032對人結腸癌細胞的抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性。較低劑量的SNS-032就可以達到很好的抑制腫瘤細胞增殖的作用;同時,可以看出不同的結腸癌細胞對藥物的敏感度不同。如圖1所示,在24 h時,藥物劑量為160 ng/mL SNS-032對HCT116細胞和SW620細胞作用效果稍差于80 ng/mL的藥物劑量,說明在短期內,細胞對較高的藥物劑量具有一定的耐藥性,因此,筆者進一步做了將病毒與不同的藥物劑量聯合處理不同的結腸癌細胞。

2.2 不同劑量的SNS-032與5 MOI的ZD55-MnSOD 病毒聯合作用于三種不同的結腸癌細胞HCT116、 HT-29、SW620的抗癌效果

以不同劑量的SNS-032與5MOI的溶瘤腺病毒聯合分別感染HCT116、HT-29、SW620細胞,在72 h后,檢測其對人結腸癌細胞的存活率的影響,結果如圖2所示。圖2可見，SNS-032與ZD55-MnSOD聯合作用時,對三種結腸癌細胞的增殖均有明顯的抑制作用,并且隨著SNS-032藥物濃度增加,對人結腸癌細胞的抗癌效果越好,在劑量為160 ng/mL的SNS-032與ZD55-MnSOD聯合作用于HT-29時,HT-29細胞存活率大約只有10%左右。

2.3 用5MOI的溶瘤腺病毒與80 ng/mL的SNS- 032藥物聯合,在不同時間對HT-29和SW620 細胞的抗癌作用

用5MOI的溶瘤腺病毒與80 ng/mL的SNS-032藥物處理HT-29細胞和SW620細胞24、48、72 h和96 h后,MTT檢測不同時間聯合處理對腫瘤細胞增殖的影響,結果如圖3。SNS-032與ZD55-MnSOD聯合作用HT-29細胞96 h時,對腫瘤細胞的殺傷作用明顯強于單獨使用病毒或藥物。SNS-032

與ZD55-MnSOD聯合作用于SW620細胞96 h時,聯合作用的效果明顯高于單獨使用藥物或病毒,并且對HT-29和SW620細胞均呈現出隨著時間的增加,作用效果越明顯,說明病毒與藥物聯合具有明顯的時間依賴性。

2.4 Western blot檢測溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD 目的基因的表達

ZD55-MnSOD,SNS-032,ZD55-MnSOD與SNS-032聯合處理HCT116細胞,劑量分別為5 MOI、80 ng/mL以及5 MOI+80 ng/mL,設立加等量的PBS作為對照組,在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,Western blot檢測目的基因MnSOD的表達，結果如圖4。圖4顯示，GAPDH為內參蛋白,單獨使用ZD55-MnSOD處理HCT116細胞表達的MnSOD比對照組和單獨使用SNS-032的量都明顯提高,并且ZD55-MnSOD與SNS-032聯合處理的表達量比任何一種也都明顯提高,說明ZD55-MnSOD與SNS-032聯合可以增加MnSOD的表達量。

2.5 Hoechst33342染色觀察細胞凋亡

通過染色,檢測病毒及藥物處理后細胞核的形態(tài)學變化及凋亡情況。如圖5所示:PBS處理的對照孔細胞沒有發(fā)生形態(tài)學的變化,細胞密度大,并且均勻鋪散開,基本沒有細胞凋亡;然而病毒與藥物處理組的細胞生長受到明顯的抑制并且出現明顯的細胞凋亡狀態(tài),發(fā)生凋亡的的細胞其細胞核染色質會發(fā)生明顯凝集、固縮、并伴有凋亡小體出現。并且,隨著藥物劑量的升高,凋亡增多。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

ZD55-MnSOD與不同劑量的SNS-032(0、20、40、80、160 ng/mL)聯合處理HCT116細胞,設立加等量PBS的對照組,在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用不含EDTA的胰酶收集細胞,AnnexinV/PI雙染參見流式試劑盒檢測細胞凋亡(圖6)。圖6(a)顯示,病毒與不同濃度的藥物聯合,所用藥物濃度越高,早期和晚期凋亡都有增加,隨著藥物劑量的提高,早期和晚期凋亡現象越明顯。在藥物劑量為160 ng/mL時,早晚期凋亡共達到12%左右。圖6(b)為統(tǒng)計學分析對照組與加藥組出現明顯差異。

3 討 論

隨著科技的不斷發(fā)展,治療癌癥的藥物大批涌現,但藥物的副作用及其抗癌效果都還很難預測,找到一種科學合理的治療方法勢在必行。本實驗采用ZD55-MnSOD與不同劑量的SNS-032聯合作用于人結腸癌細胞株,實驗證明二者的聯合作用比單獨使用病毒或單獨使用藥物效果均要顯著,可以有效地抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡。MTT結果表明,單獨使用藥物處理人結腸癌細胞時,在一定范圍內隨著藥物劑量的增加,藥物對腫瘤細胞的增殖有抑制作用,但較高的藥物劑量時,會降低對腫瘤細胞的抑制能力。然而,用病毒與藥物聯合處理人結腸癌細胞,隨著藥物劑量的增加,對腫瘤細胞的殺傷能力越強,并且,二者的聯合具有時間依賴性。Hoechst33342染色觀察發(fā)現,單獨SNS-032或ZD55-MnSOD處理的細胞只有很少凋亡現象出現。而藥物聯合組有明顯的凋亡小體出現,并且有大量細胞發(fā)生凋亡。應用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡,驗證發(fā)現與MTT結果符合,發(fā)現二者聯合作用時,能有效地促進人結腸癌細胞發(fā)生凋亡,并且凋亡多發(fā)生于凋亡早期階段。在本實驗中,為了降低過高的病毒劑量可能會增加治療的風險,采用較低的病毒劑量與藥物聯合,這樣既能降低各自的劑量,又能達到很高的抗腫瘤效果。然而,ZD55-MnSOD聯合SNS-032時,最佳協同作用的劑量以及具體的引起它們聯合作用的機制仍有待進一步研究。并且筆者所用的SNS-032并不是具有廣譜性的抗癌藥物,因為有研究表明它對某些細胞具有一定的耐藥性,由于具有耐藥性,有可能需加大藥物的使用劑量,因此,SNS-032對其他腫瘤細胞的治療效果還有待進一步驗證。本實驗為以后的體內實驗打下理論基礎,對臨床實驗也具有一定的參考價值。

[1] Fernandez U I, Hammer K, Arndt M A, et al. Genetic delivery of an immunoRNase by an oncolytic adenovirus enhances anticancer activity[J]. Int J Cancer, 2014, 136(9): 2228-2240.

[2] Chen X J, Zhang K, Xin Y, et al. Oncolytic adenovirus-expressed RNA interference of O-methylguanine DNA methyltransferase activity may enhance the antitumor effects of temozolomide[J]. Oncol Lett, 2014, 8(5): 2201-2202.

[3] Kirn D, Niculescu-Duvaz I, Hallden G, et al. The emerging fields of suicide gene therapy and virotherapy[J]. Trends Mol Med, 2002, 8(S4): 68-73.

[4] Kirn D. Replication-selective oncolytic adenoviruses: virotherapy aimed at genetic targets in cancer[J]. Oncogene, 2000, 19(56): 6660-6669.

[5] Bravard A, Sabatier L, Hoffschir F, et al. SOD2: a new type of tumor-suppressor gene?[J]. Int J Cancer, 1992, 51(3): 476-480.

[6] Zhang Y H, Gu J F, Zhao L L. Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combined manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene virotherapy[J]. Cancer Res, 2006, 66(8): 4291-4298.

[7] Kinnula V L, Crapo, J D. Superoxide dismutases in the lung and human lung diseases[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2003, 167(12): 1600-1619.

[8] Oberley T D, Zhong W, Szweda L I, et al. Localization of antioxidant enzymes and oxidative damage products in normal and malignant prostate epithelium[J]. Prostate, 2000, 44(2): 144-155.

[9] Hur G C, Cho S J, Kim C H, et al. Manganese superoxide dismutase expression correlates with chemosensitivity in human gastric Cancer Cell lines[J]. Clinical Cancer Research, 2003, 9(15): 5768-5775.

[10] Hwang T S, Choi H K, Han H S. Differential expression of manganese superoxide dismutase, copper/zinc superoxide dismutase, and catalase in gastric adenocarcinoma and normal gastric mucosa[J]. Eur J Surg Oncol, 2007, 33(4): 474-479.

[11] Misra R N, Xiao H Y, Kim K S, et al. N-(cycloalkylamino)acyl-2-aminothiazole inhibitors of cyclin-dependentkinase2-N-[5-[[[5-(1, 1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinecarboxamide(BMS-387032), a highly efficacious and selective antitumor agent[J]. J Med Chem, 2004, 47(7): 1719-1728.

[12] Mukhopadhyay P, Ali M A, Nandi A, et al. The cyclin-dependent kinase 2 inhibitor down-regulates interleukin-1beta-mediated induction of cyclooxygenase-2 expression in human lung carcinoma cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(3): 1758-1766.

[13] Simon F S, Peter K, Jenifer B, et al. Transient treatment with CDK inhibitors eliminates proliferative potential even when their abilities to evoke apoptosis and DNA damage are blocked[J]. Cell Cycle, 2008, 7(24): 3898-3907.

[14] Ali M A, Choy H, Habib A A, et al. SNS-032 prevents tumor cell-induced angiogenesis by inhibiting vascular endothelial growth factor[J]. Neoplasia, 2007, 9(5): 370-381.

[15] Chen R, Chubb S, Cheng T, et al. Responses in mantle cell lymphoma cells to SNS-032 depend on the biological context of each cell line[J]. Cancer Res, 2010, 70(16): 6587-6597.

[16] Heath Elisabeth I, Bible K, Martell R E, et al. A phase 1 study of SNS-032 (formerly BMS-387032), a potent inhibitor of cyclin-dependent kinases 2, 7 and 9 administered as a single oral dose and weekly infusion in patients with metastatic refractory solid tumors[J]. Invest New Drugs, 2008, 26(1): 59-65.

[17] Wu Y B, Chen C, Sun X Y, et al. Cyclin-dependent kinase 7/9 inhibitor SNS-032 abrogates FIP1-like-1 platelet-derived growth factor receptor alpha and bcr-abl oncogene addiction in malignant hematologic cells[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(7): 1966-1978.

[18] Amelie B, Tina C, Greg H E. Chemoprevention of mouse intestinal tumorigenesis by the cyclin-dependent kinase inhibitor SNS-032[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2009, 2(9): 800-806.

[19] Xie G E, Tang H P, Wu S Q, et al. The cyclin-dependent kinase inhibitor SNS-032 induces apoptosis in breast cancer cells via depletion of Mcl-1 and X-linked inhibitor of apoptosis protein and displays antitumor activity in vivo[J]. Int J Oncol, 2014, 45(2): 804-812.

[20] Tong W G, Chen R, Plunkett W, et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective CDK2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma[J]. Journal of Clinical Oncology, 2010, 28(18): 3015-3022.

[21] 祁瑞哲, 紀 慶, 張麗艷, 等. 細胞周期抑制劑SNS-032對小鼠造血干細胞生物活性的影響研究[J]. 中國實驗血液學雜志, 2013, 21(3): 741-745.

[22] Conroy A, Stockett D E, Walker D, et al. SNS-032 is a potent and selective CDK 2, 7 and 9 inhibitor that drives target modulation in patient samples[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2009, 64(4): 723-732.

(責任編輯： 許惠兒)

In-Vitro Inhibitory Effect of Oncolytic Adenovirus ZD55-MnSODCombined with New CDK Inhibitor on Human Colon Cancer Cells

HAN Jian-cuia, MA Bu-yuna, WU Cheng-yua, WANG Yi-ganga, WANG Shi-binga,b

(a. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology, b. Research Centre, School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

The research is to develop in-vitro inhibitory effect of MnSOD carried oncolytic adenovirus Ad-E1B55Kd-MnSOD (ZD55-MnSOD) combiend with small molecular drug novel CDK inhibitor SNS-032 on colon cancer cell lines such as SW620, HCT116 and HT-29. Oncolytic virus and drugs were combined to seek good antitumor effects. In this experiment, MTT was used to detect the application effect of 5MOI ZD55-MnSOD combined with different dosage of SNS-032 (0, 20, 40, 80, 160 ng/mL) on human colon cell line. The authors found that the combination of oncolytic virus and drug could promot tumor cell apoptosis; and also found that treatment of SW620 and HT-29 with combined ZD55-MnSOD (5 MOI) and SNS-032 (80 ng/mL) had great time dependence. Hoechst33342 staining method and flow cytometry were used to detect apoptosis. The results aslo show that the apoptosis phenomenon in the group of combined use of ZD55-MnSOD with SNS-032 has better effects than separate use of oncolytic virus or drug alone. This research preliminarily proves ZD55-MnSOD (5 MOI) and SNS-032 have supplementary effect and can effectively inhibit the growth of colon cancer cells in vitro.

oncolytic adenovirus; SNS-032; colon cancer; antitumor effect

1673- 3851 (2015) 05- 0688- 06

2014-09-26

國家自然科學基金項目(81272687);浙江省自然科學基金項目(LY13H080005,LZ13H160004);浙江省科技計劃項目(2014C37101);浙江理工大學科研啟動基金項目(1204807-Y)

韓劍翠(1988-),女,黑龍江林口人,碩士研究生,主要從事腫瘤的靶向基因-病毒治療方面的研究。

王世兵,E-mail:wsb@zstu.edu.cn

Q789

A