毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

肖鋒綜述，譚軍審校

（1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形激光美容外科湖南長(zhǎng)沙410000；2.湖南省人民醫(yī)院整形激光美容外科湖南長(zhǎng)沙410000）

毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

肖鋒1綜述，譚軍2審校

（1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形激光美容外科湖南長(zhǎng)沙410000；2.湖南省人民醫(yī)院整形激光美容外科湖南長(zhǎng)沙410000）

毛囊干細(xì)胞是皮膚組織工程理想的種子細(xì)胞，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。分離培養(yǎng)及鑒定是其研究的基礎(chǔ)手段，作者將近年來(lái)毛囊干細(xì)胞幾種常用的分離培養(yǎng)及鑒定方法進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析、總結(jié)和歸納，為毛囊干細(xì)胞的深入研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

毛囊干細(xì)胞；鑒定；分離培養(yǎng)

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，存在于胚胎及成體內(nèi)。在一定條件下，干細(xì)胞可以無(wú)限增殖而保持未分化狀態(tài)，也可以分化成多種功能細(xì)胞。20世紀(jì)，Cotsarel is、Taylor等［1］通過(guò)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊上部由外根鞘形成的明顯突起，即隆突區(qū)域也有干細(xì)胞的存在，這些干細(xì)胞被定義為毛囊干細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞與其他成體干細(xì)胞一樣擁有強(qiáng)大的增殖能力及多向分化潛能［2］。毛囊干細(xì)胞能通過(guò)自身的分裂增殖產(chǎn)生各種機(jī)體所需的細(xì)胞，以補(bǔ)充脫落和缺失的細(xì)胞；毛囊干細(xì)胞不僅能夠向下轉(zhuǎn)移到毛囊根部生成毛囊，而且還能從毛囊外根鞘向上遷移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪［3-4］。近年來(lái)，毛囊干細(xì)胞的研究備受關(guān)注，已成為研究熱點(diǎn)之一。目前，存在多種毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法，為毛囊干細(xì)胞的深入研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，作者就毛囊干細(xì)胞常用的分離培養(yǎng)及鑒定作一簡(jiǎn)要綜述。

1　毛囊干細(xì)胞的分離純化

此前，已有許多研究者采用不同的方法來(lái)分離毛囊干細(xì)胞，并成功地進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)更深入的研究。目前對(duì)毛囊干細(xì)胞分離純化常用的有以下幾種方法：

1.1組織塊培養(yǎng)法

取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用PBS液沖洗，將皮膚切成小塊，表皮朝上貼于加入適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法分離的干細(xì)胞能持續(xù)保持增殖趨勢(shì)，沒(méi)有明顯的平臺(tái)期，并且隨著不斷傳代純化，此方法獲得的毛囊干細(xì)胞純度明顯增加。但是組織塊培養(yǎng)法分離獲取毛囊干細(xì)胞的效率較低。史明艷等［5］使用該方法成功獲得毛囊干細(xì)胞，并分析指出該方法的優(yōu)勢(shì)在于組織塊培養(yǎng)時(shí)從組織塊中遷移出來(lái)其他細(xì)胞為毛囊干細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)類似于體內(nèi)的微環(huán)境，使毛囊干細(xì)胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2顯微分離技術(shù)

取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高濃度青、鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗3次；在超凈工作臺(tái)內(nèi)，顯微鏡下顯微鑷鈍性分離單個(gè)毛囊組織，收集形態(tài)完好且處于生長(zhǎng)期的毛囊。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入含培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。顯微分離技術(shù)能從樣本直接選取毛囊干細(xì)胞相對(duì)富集區(qū)域，有利于后續(xù)進(jìn)一步的純化［6］。王祝遷等［7］使用此方法成功分離出大鼠毛囊干細(xì)胞，但單純應(yīng)用顯微分離技術(shù)獲取高純度的毛囊干細(xì)胞需花費(fèi)大量的時(shí)間和精力，效率偏低。

1.3酶消化法

取含有待培養(yǎng)毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用含雙抗PBS液沖洗，將皮膚樣本剪成小塊，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃搖床消化2h。取出組織用PBS沖洗3遍，置于胰蛋白酶（質(zhì)量濃度為2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃搖床消化1h后，過(guò)200目鋼網(wǎng)。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。此方法獲得的毛囊干細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)，獲取效率高。鄭宣等［8］用此法獲得較純的毛囊干細(xì)胞，但獲得的毛囊干細(xì)胞經(jīng)歷增殖期后生長(zhǎng)速度逐漸減慢，且細(xì)胞存活率下降，可能與酶消化法破壞了毛囊干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境有關(guān)。

1.4差數(shù)貼壁法

將收集的細(xì)胞接種于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿中，靜置20min后，收集上層未貼附角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊真皮成纖維細(xì)胞于另一培養(yǎng)皿中，貼附皿底的毛囊干細(xì)胞，置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，每3d換液一次。與單純使用某種毛囊干細(xì)胞分離方法相比較，聯(lián)合差數(shù)貼壁法將更進(jìn)一步純化，獲得純度更高的毛囊干細(xì)胞。彭彧等［9］使用酶消化法聯(lián)合差數(shù)貼壁法獲得了形態(tài)典型且均勻一致的毛囊干細(xì)胞。目前此方法已被廣泛使用。

1.5免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用來(lái)純化分離培養(yǎng)獲得的毛囊隆突區(qū)細(xì)胞中某種標(biāo)記物陽(yáng)性的細(xì)胞。首先制作細(xì)胞懸液，并加入FITC標(biāo)記的某種標(biāo)記物單抗，室溫孵育30min，離心后棄上清中未結(jié)合的抗體，加入磁珠分選緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心后棄上清，PBS緩沖液清洗2次，取重懸后細(xì)胞與免疫磁珠混合，室溫反應(yīng)30min。磁珠分離器分離8min，去除未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞。將結(jié)合了靶細(xì)胞的免疫磁珠用磁珠分選緩沖液洗5次。體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)48h，使細(xì)胞與磁珠分離，即可獲得較純的毛囊干細(xì)胞。譚挺等［10］用此法獲得高純度毛囊干細(xì)胞，他們指出此方法與顯微分離技術(shù)連用有單次操作分離細(xì)胞數(shù)量大且純度較高、能與細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡等分子生物學(xué)技術(shù)兼容等特點(diǎn)。黃恩毅等［11］用此法有效分離并成功培養(yǎng)CD34+毛囊干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)分選后的細(xì)胞仍具有較好的活性，且增殖速度快，增殖期長(zhǎng)。盧葳等［6］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，免疫磁珠分選后毛囊干細(xì)胞活力較好，分離獲得的毛囊干細(xì)胞適合用于細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)等后續(xù)試驗(yàn)。

1.6流式細(xì)胞儀分選法

通過(guò)毛囊干細(xì)胞表達(dá)的某些特異性標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀可以將目的活細(xì)胞從異質(zhì)性細(xì)胞群中分離出來(lái)，獲得較高純度的特異性細(xì)胞。常用的是熒光激活細(xì)胞分選器。盧葳等［6］使用流式細(xì)胞儀分選CD34+毛囊干細(xì)胞，獲得的毛囊干細(xì)胞純度很高、污染機(jī)會(huì)小，但是分選過(guò)程費(fèi)時(shí)，細(xì)胞分選后活力稍差。此方法適合于需要做免疫組化，蛋白質(zhì)組織學(xué)等對(duì)細(xì)胞純度要求高的實(shí)驗(yàn)。

2　毛囊干細(xì)胞的鑒定

干細(xì)胞的鑒定一直是干細(xì)胞研究的難點(diǎn)，常用干細(xì)胞的標(biāo)記物輔助方法進(jìn)行鑒定。毛囊干細(xì)胞有多種明確的分子標(biāo)記物，如CD34、K15、K19［12］。

2.1角蛋白家族

角蛋白是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于生物體的組織結(jié)構(gòu)中。在表皮細(xì)胞中，它們以微絲的狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)形成廣泛的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在上皮組織中有20多種不同種類的角蛋白表達(dá)。在表皮細(xì)胞中，隨著分化程度的不同其所表達(dá)的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作為毛囊干細(xì)胞的鑒定手段。1998年，lyle等［13］通過(guò)表達(dá)克隆發(fā)現(xiàn)K15是毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記之一，此后K15一直被當(dāng)做較為公認(rèn)的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物。20世紀(jì)末，有研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滯留細(xì)胞所在的毛囊隆突部細(xì)強(qiáng)表達(dá)K19［14］；同時(shí)有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛囊隆突部K19高表達(dá)細(xì)胞缺乏特異性分化標(biāo)志，進(jìn)一步證實(shí)K19高表達(dá)細(xì)胞為毛囊干細(xì)胞，因此，認(rèn)為K19也可作為毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記物［15］。在毛囊干細(xì)胞分化過(guò)程中，K15表達(dá)減弱較K19早，K19表達(dá)陽(yáng)性而K15陰性的細(xì)胞仍有可能為處于早期階段的增殖細(xì)胞，因此推測(cè)，檢測(cè)毛囊干細(xì)胞時(shí)K15更準(zhǔn)確［13］。

2.2鈣黏蛋白家族

鈣黏蛋白是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的細(xì)胞黏著糖蛋白，對(duì)胚胎發(fā)育中的細(xì)胞識(shí)別、遷移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。不同細(xì)胞及發(fā)育不同階段其細(xì)胞表面的鈣黏蛋白的種類與數(shù)量均有所不同，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十種鈣黏蛋白。CD34抗原是鈣黏蛋白中的一種，是一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，為階段特異性白細(xì)胞分化抗原，CD34表達(dá)于人類造血干細(xì)胞，CD34是目前公認(rèn)的造血干細(xì)胞標(biāo)志物。Ohyama等［16］通過(guò)對(duì)鼠毛囊的研究，發(fā)現(xiàn)鼠毛囊中CD34陽(yáng)性細(xì)胞與毛囊隆突部滯留細(xì)胞和K15陽(yáng)性細(xì)胞在毛囊處位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物。Trempus等［17］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了CD34表達(dá)于小鼠毛囊干細(xì)胞。但CD34在人毛囊干細(xì)胞不表達(dá)，Shu Jiang等［18］通過(guò)對(duì)人頭皮進(jìn)行原位免疫組化和多色免疫熒光標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)CD34特異性表達(dá)于毛囊間表皮基底部。

2.3整合素家族

整合素是機(jī)體重要的黏附分子，是廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞表面的一類細(xì)胞跨膜蛋白，在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間及細(xì)胞與細(xì)胞間起黏附作用，整合素是由α和β兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，它們按不同的組合構(gòu)成20余種整合素。目前，整合素也被廣泛用于毛囊干細(xì)胞的鑒定，常用的整合素為整合素β1。1995年，Jones等［19］根據(jù)表皮細(xì)胞表達(dá)整合素β1的水平將其進(jìn)行分組培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達(dá)的表皮細(xì)胞比低表達(dá)者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Wat t等［20］發(fā)現(xiàn)，富含整合素β1的皮膚基底細(xì)胞比整合素β1含量少的皮膚基底細(xì)胞能更快速的黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述發(fā)現(xiàn)均為整合素β1作為毛囊干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物提供有力支持。

3　結(jié)論

綜上，目前常用的分離培養(yǎng)方法主要包括：組織塊培養(yǎng)法、顯微分離技術(shù)、酶消化法、差數(shù)貼壁法、免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀分選法，每種方法均有各自的優(yōu)勢(shì)及缺陷；組織塊培養(yǎng)法簡(jiǎn)單，但是分離純度不高，分離效率低下；顯微分離技術(shù)相對(duì)其他方法而言，分離純度高，但是分離過(guò)程比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力；酶消化法效率高，但是酶消化過(guò)程同時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞微環(huán)境，影響細(xì)胞存活率；差數(shù)貼壁法一般聯(lián)合其他分離純化方法，能進(jìn)一步純化所獲毛囊干細(xì)胞；免疫磁珠法獲得的毛囊干細(xì)胞純度高、活性強(qiáng)，但是分離方法較復(fù)雜；流式細(xì)胞儀分選法所獲得毛囊干細(xì)胞純度高，但細(xì)胞活性低。因此，在選擇毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法時(shí)一定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特殊要求及實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的方法。毛囊干細(xì)胞的鑒定方法常用的包括：角蛋白家族、鈣黏蛋白家族、整合素家族；實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，同時(shí)檢測(cè)兩種以上的標(biāo)記物來(lái)鑒定毛囊干細(xì)胞是較為準(zhǔn)確的一種方法。

毛囊干細(xì)胞具有其他干細(xì)胞的共同特征，具有多向分化潛能。目前，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)毛囊干細(xì)胞能用于尿道缺損、神經(jīng)損傷的修復(fù)；能夠分化成為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞［1，21-22］；能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合，將其作為工程皮膚中的種子細(xì)胞，有利于表皮細(xì)胞及汗腺、毛囊等附屬器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干細(xì)胞有利于瘢痕的修復(fù)，但該研究仍處于起步階段，相信經(jīng)過(guò)研究者們的不懈努力，其必將為瘢痕治療這一世界性難題提供一種有效的新方法。

［1］趙奎，賈宗菲，弓慧敏，等.毛囊干細(xì)胞的分離方法及應(yīng)用［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：82-85.

［2］Wu JC，Yang TT，Xu X，et al.Research on differentiation of human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes invitro［J］.JMed Postgra，2010，23（2）：128-132.

［3］原璐，王春生，安鐵洙，等.毛囊干細(xì)胞研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物雜志，2009，29（1）：75-79.

［4］Jaks V，Barker N，Kasper M，et al.Igr5 marks cycling，yet long-lived，hair follicle stem cells［J］.Nat Genet，2008，40（11）：1291-1299.

［5］史明艷，楊學(xué)義，竇忠英.山羊毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（5）：436-440.

［6］盧葳，陳瑾，李惠.兩種純化大鼠毛囊干細(xì)胞方法的比較［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35（1）：124-126.

［7］王祝遷，木拉提·熱夏提，李佳，等.大鼠觸須毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（27）：5031-5034.

［8］鄭宣，許世超，全仁夫.大鼠毛囊干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及相關(guān)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2014，22（2）：8-14.

［9］彭彧，王玉杰，李佳，等.不同體積分?jǐn)?shù)富血小板血漿與大鼠毛囊干細(xì)胞的增殖［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（45）：8501-8505.

［10］譚挺，胡志奇，周洪軍.顯微分離培養(yǎng)與免疫磁珠法分離純化人毛囊干細(xì)胞［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2008，22（2）：202-205.

［11］黃恩毅，楊恬，陳偉，等.毛囊干細(xì)胞的純化培養(yǎng)鑒定及其生物學(xué)特性［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（1）：39-42.

［12］Tsai SY，Clavel C，Kim S，et al.Oct4 and k lf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells［J］. Stem Cells，2010，28（2）：221-228.

［13］Lyle S，Christofidou-Solom idou M，Iiu Y，etal.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the 10-8 cation of human hair follicle stem cells［J］. JCell Sci，1998，111：3179-3188.

［14］M ichel M，Torok N，Godbout M J，et al.Keratin 19 as a biochemicalmarker of skin stem cells in vivo and in vitro：keratin 19 expressing cells are differentially 10 calized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage［J］.JCell Sci，1996，109：1017-1028.

［15］Reynolds AJ，Jahoda CA.Hair follicle stem cells A distinct germ inative epidermal cell population is active in vitro by the presenceof hair dermal papillar cells［J］.JCell Sci，1991，99：373-385.

［16］Ohyama M，Terunuma A，Tock CL，et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells［J］.JClin Invest，2006，116（1）：249-260.

［17］Trempus CS，Morris RJ，Bortner CD，et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34［J］.J Invest Dermatol，2003，120（4）：501-511.

［18］Shu Jiang，Longmei Zhao，Bham ini Purandare，et al. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments［J］.Histochem Cell Biol，2010，133：455-465.

［19］Jones PH，Harper S，Watt FM.Stem cell patterning and fate in human epidermis［J］.Cell，1995，80（1）：83-93.

［20］Watt FM.Epidermal stem cells：markers，patterning and the controlof stem cell fate［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1998，353（1370）：831-837.

［21］蔡霞.人毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定與生物學(xué)特性的初步研究［J］.四川醫(yī)學(xué)，2014，35（1）：1-3.

［22］彭文標(biāo)，劉春曉，謝群，等.富集兔毛囊干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化尿道的研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（3）：285-289.

編輯/李陽(yáng)利

The cultivation and identification of hair follicle stem cells

XIAO Feng1，TAN Jun2
（Departmentof Plastic and Laser Aesthetic Surgery，Peop le's Hosp italofHunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）

Hair follic le stem cells are the ideal seed cells for skin tissue eng ineering，which has become a hot research top ic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author w ill analyze and summarize severalmethods o f isolation and culture o f hair follic le stem cells in recentyears.Itwillp rovide a solid foundation for the further study ofhair follic le stem ce lls.

hair follic le stem cells；identification；cultivation

R329.2

A

1008-6455（2015）19-0077-04

2015-07-07

2015-08-30