寧夏馬鈴薯Y病毒（PVY）外殼蛋白基因分子變異分析

陳曉軍　樊云芳　王敬東　等

摘要：馬鈴薯（Solanum tuberosum）Y病毒（Potato virus Y， PVY）是危害我國馬鈴薯的主要病毒之一。利用馬鈴薯Y病毒通用ELISA試劑盒確定所攜帶Y病毒的試驗材料，設計了特異性引物通過反轉錄PCR獲得PVY CP基因序列，通過克隆PVY衣殼蛋白基因（Coat protein， CP）序列分析其進化與變異類型。結果表明，分離得到11株病毒，依據(jù)其CP序列特性分為4類；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYO進化分枝，同時也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒分離株的9.1%。結果揭示了寧夏地區(qū)PVY的進化與變異類型，有助于針對性地防控PVY。

關鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosum）；馬鈴薯Y病毒；分子變異

中圖分類號：S532 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5558-04

馬鈴薯（Solanum tuberosum）Y病毒（Potato virus Y， PVY）在世界各地均有報道，其能侵染34個屬170余種植物，但主要以茄科作物為主[1]。PVY是危害我國馬鈴薯的主要病毒之一[2]。PVY包括3個株系組：馬鈴薯Y病毒普通株系組（PVYO）、馬鈴薯點條斑株系（PVYc）、馬鈴薯Y病毒褐脈株系（PVYN）[3]。PVY染病植株25 ℃時其體內(nèi)病毒濃度最高，有利于該病的發(fā)生；30 ℃時染病植株體內(nèi)病毒濃度最低，表現(xiàn)為隱癥。PVYO和PVYC初期感染癥狀主要是葉片壞死和斑駁；PVYN則導致不同程度的花葉。PVYO和PVYC繼發(fā)侵染的植株表現(xiàn)出矮化、皺縮、斑駁和卷曲等癥狀；而PVYN感染植株通常為花葉和斑駁，當溫度低于10 ℃和高于25 ℃時，不表現(xiàn)花葉癥狀。PVY通常不引發(fā)塊莖病癥，但近年來在歐洲出現(xiàn)PVYN中的一個株系PVYNTN，PVYNTN株系具有PVYN株系的血清型，在煙草和馬鈴薯地上部分引起的癥狀與PVYN株系相似。同時PVYNTN株系還可引起馬鈴薯塊莖壞死、環(huán)斑病，在塊莖的內(nèi)部或外部引起環(huán)狀、弧狀壞死斑，嚴重影響馬鈴薯的品質(zhì)和經(jīng)濟價值[1]。

血清學方法最常用于PVY株系的鑒定，但單純的血清學關系已被證明不完全可靠，因為許多病毒編碼的蛋白質(zhì)都有高度保守的區(qū)域，即使親緣關系很遠的病毒在這些保守區(qū)域序列也可能相近，導致血清學反應難以區(qū)分。近年來，隨著基因測序技術的成熟，大量病毒衣殼蛋白（Coating Protein，CP）基因的序列被測定，而且測定了不少病毒的全序列。CP基因序列分析在一定程度上對闡明PVY分類具有一定的參考作用[4，5]。

RNA植物病毒的遺傳多樣性主要由突變、重組、重排等因素造成[6-8]，以快速適應多變的生存環(huán)境。PVY突變頻率較高、重組頻繁，造成遺傳多樣性變化很大，因此能在不同寄主和不同環(huán)境中生存與傳播。研究病毒變異和進化有助于了解病毒的起源、進化機制、分類關系和種群遺傳結構的形成。本研究對寧夏地區(qū)流行的馬鈴薯Y病毒CP基因進行測序，研究其分子變異，有助于掌握該病毒的變異類型與流行區(qū)域，從而更為有效地防控該病毒的大面積流行。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年，在寧夏固原農(nóng)業(yè)推廣總站馬鈴薯種質(zhì)資源圃中，收集195份疑似攜帶馬鈴薯Y病毒樣本。該資源圃中種植了目前全區(qū)大多數(shù)主栽馬鈴薯品種，選擇有病理癥狀明顯，從植株的頂部、中部和底部各取一片葉子合在一起，帶回實驗室-70 ℃低溫保存。

1.2 試劑

馬鈴薯Y病毒通用ELISA試劑盒購于安德珍生物公司；SV Total RNA Isolation System RNA提取試盒、mProm-II Reverse Transcriptase RNA反轉錄試劑盒、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000 plus購于天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；其他化學試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯Y的鑒定 稱取0.10～0.15 g馬鈴薯病葉樣品放置于樣品袋中，并標記；然后向樣品袋中加入1.0～1.5 mL試劑盒提取緩沖液，將樣品充分研磨；將樣品袋中的溶液轉移到1.5 mL的離心管中，4 000 r/min離心3 min，取上清液備用。按試劑盒說明進行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）鑒定馬鈴薯病葉樣品，在典型陽性植株中根據(jù)顯色吸光度由高到低選取11株備用。

1.3.2 馬鈴薯總RNA的提取 采用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取樣品總RNA，然后保存于-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.3 引物設計 從GenBank中獲得PVY CP基因核苷酸序列（HQ631374.1、AY601680.1、HM036202.1），并利用BLAST和Clustal軟件進行保守性分析，上游引物序列PVY_CPF：5′-GGAAATGACACAATCGATGCAGG-3′和下游引物序列PVY_CPR：5′-CATGTTCTTGACTCCAAGTAGAG-3′。

1.3.4 RT-PCR擴增PVY CP基因 取2 μg馬鈴薯總RNA，以Oligo dT為引物，進行總cDNA反轉錄。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，cDNA反轉錄產(chǎn)物為模板PCR擴增PVY CP基因。PCR反應體系為25 μL，包含10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，Pfu高保真聚合酶（5 U/μL）1 μL，總cDNA模版（1 μg/μL）1 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送天根生化科技（北京）有限公司進行測序。endprint

1.3.5 PVY CP基因序列分析 對PVY CP基因序列進行BLAST比對，DNAMAN7.0進行生物信息學分析。進化樹采用MEGA軟件繪制，計算方法采用Neighbor-joining方法[9]。

2 結果與分析

2.1 PVY陽性植株的鑒定

經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽性植株分別編號為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。

2.2 PVY CP基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取陽性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結果見圖1，泳道1、2均為PVY陽性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉錄為模板進行PVY CP基因的RT-PCR擴增，結果見圖2。由圖2可知，11個樣品擴增出了801 bp的目標片段，與預期大小一致，表明成功擴增出了CP基因。

2.3 PVY CP基因的生物信息學分析

11個樣品PVY分離株 CP基因的序列與GenBank 上已公布的PVY 不同分離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達99.4%。根據(jù)Potyvirus 病毒劃分種的標準，當CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時，應歸為同一個種。因此，11個分離株應為PVY分離株。

11個分離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計57個位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒有發(fā)生變化，編碼267個氨基酸序列，造成16個氨基酸序列存在變異（圖3）。

該地區(qū)PVY的親緣關系見圖4。由圖4可知，11個分離株可分為4類。第一類PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個不同省份PVY分離株（圖4中藍色框標識部分）聚類到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說明在本地區(qū)馬鈴薯長期種植過程中，PVY病毒進化有別于其他省份分離得到的病毒株系，發(fā)展成為較新的一類型。第二類PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類同屬于PVY O型這一進化分枝；第三類PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之間。第四類PVY35，與本次分離得到的其他株系關系較遠，同源性僅為93%，因此，將此分離株CP基因序列注冊GenBank，登入號為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。

2.4 寧夏地區(qū)PVY類型分析

在核苷酸水平根據(jù)PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35分離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余分離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)PVY CP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。分離株PVY35可能為PVYNTN型，其余分離株屬于PVY O型進化分枝。據(jù)此，推測寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVY O型進化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3種病毒類型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%（10/11），但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%（1/11）。

3 小結與討論

PVY不同株系間可能具有相同的血清型或生物學特性，單獨利用免疫學技術和接種鑒別寄主等方法均無法對各株系進行準確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測能很核苷酸水平準確檢測其基因型，這對快速掌握和防控PVY流行趨勢具有一定的指導意義。本研究設計的引物為擴增PVY CP基因全長序列，其能提供更多的分型位點，在一定程度上彌補了血清學檢測的不足。通過PVY通用型ELSIA試劑盒對寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進行檢測，共檢測出11株PVY分離株，對這些病毒的衣殼蛋白基因進行測序，可以劃分為4個類型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。

近20年來，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長的趨勢并偶有分布。高芳鑾等[10]對中國PVY病毒進行了CP基因變異研究，但沒有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測出PVY病毒11株，僅占整個檢測材料的5.64%，這個原因可能是由于多病毒復合感染，造成類似表型。

參考文獻：

[1] 張 帥.我國主要煙區(qū)PVY株系分化研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，2010.

[2] 楊慶東，吳興泉，陳士華，等.PVY株系間的分子變異及分子鑒定方法[J].中國馬鈴薯，2011，25（3）：166-169.

[3] 劉金亮，四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的分子變異及HC-Pro結構對抑制RNA沉默的影響[D]，山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2007.

[4] 江 彤，陳 偉.來自安徽不同寄主PVY分離物的血清學鑒定及其cp基因分子進化分析[J].植物病理學報，2009，39（5）： 540-543.

[5] 李向東，李懷方，范在豐.馬鈴薯Y病毒屬病毒的分子生物學研究進展[J].微生物學通報，1999（4）：283-285.

[6] ROOSSINCK M J. Mechanisms of plant virus evolution[J]. Annu Rev Phytopathol，1997，35：191-209.

[7] ROOSSINCK， M J. Plant RNA virus evolution[J]. Curr Opin Microbiol， 2003， 6： 406-409.

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[9] TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28（10）： 2731-2739.

[10] 高芳鑾，沈建國，史鳳陽，等. 中國馬鈴薯Y病毒的檢測鑒定及CP基因的分子變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（15）： 3125-3133.

[11] KARASEV，A V，HU X，BROWN C，et al. Genetic diversity of the ordinary strain of potato virus Y（PVY） and origin of recombinant PVY strains[J]. Phytopathology，2011，101（7）：778-785.

（責任編輯 屠 晶）endprint

1.3.5 PVY CP基因序列分析 對PVY CP基因序列進行BLAST比對，DNAMAN7.0進行生物信息學分析。進化樹采用MEGA軟件繪制，計算方法采用Neighbor-joining方法[9]。

2 結果與分析

2.1 PVY陽性植株的鑒定

經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽性植株分別編號為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。

2.2 PVY CP基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取陽性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結果見圖1，泳道1、2均為PVY陽性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉錄為模板進行PVY CP基因的RT-PCR擴增，結果見圖2。由圖2可知，11個樣品擴增出了801 bp的目標片段，與預期大小一致，表明成功擴增出了CP基因。

2.3 PVY CP基因的生物信息學分析

11個樣品PVY分離株 CP基因的序列與GenBank 上已公布的PVY 不同分離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達99.4%。根據(jù)Potyvirus 病毒劃分種的標準，當CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時，應歸為同一個種。因此，11個分離株應為PVY分離株。

11個分離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計57個位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒有發(fā)生變化，編碼267個氨基酸序列，造成16個氨基酸序列存在變異（圖3）。

該地區(qū)PVY的親緣關系見圖4。由圖4可知，11個分離株可分為4類。第一類PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個不同省份PVY分離株（圖4中藍色框標識部分）聚類到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說明在本地區(qū)馬鈴薯長期種植過程中，PVY病毒進化有別于其他省份分離得到的病毒株系，發(fā)展成為較新的一類型。第二類PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類同屬于PVY O型這一進化分枝；第三類PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之間。第四類PVY35，與本次分離得到的其他株系關系較遠，同源性僅為93%，因此，將此分離株CP基因序列注冊GenBank，登入號為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。

2.4 寧夏地區(qū)PVY類型分析

在核苷酸水平根據(jù)PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35分離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余分離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)PVY CP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。分離株PVY35可能為PVYNTN型，其余分離株屬于PVY O型進化分枝。據(jù)此，推測寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVY O型進化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3種病毒類型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%（10/11），但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%（1/11）。

3 小結與討論

PVY不同株系間可能具有相同的血清型或生物學特性，單獨利用免疫學技術和接種鑒別寄主等方法均無法對各株系進行準確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測能很核苷酸水平準確檢測其基因型，這對快速掌握和防控PVY流行趨勢具有一定的指導意義。本研究設計的引物為擴增PVY CP基因全長序列，其能提供更多的分型位點，在一定程度上彌補了血清學檢測的不足。通過PVY通用型ELSIA試劑盒對寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進行檢測，共檢測出11株PVY分離株，對這些病毒的衣殼蛋白基因進行測序，可以劃分為4個類型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。

近20年來，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長的趨勢并偶有分布。高芳鑾等[10]對中國PVY病毒進行了CP基因變異研究，但沒有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測出PVY病毒11株，僅占整個檢測材料的5.64%，這個原因可能是由于多病毒復合感染，造成類似表型。

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[10] 高芳鑾，沈建國，史鳳陽，等. 中國馬鈴薯Y病毒的檢測鑒定及CP基因的分子變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（15）： 3125-3133.

[11] KARASEV，A V，HU X，BROWN C，et al. Genetic diversity of the ordinary strain of potato virus Y（PVY） and origin of recombinant PVY strains[J]. Phytopathology，2011，101（7）：778-785.

（責任編輯 屠 晶）endprint

1.3.5 PVY CP基因序列分析 對PVY CP基因序列進行BLAST比對，DNAMAN7.0進行生物信息學分析。進化樹采用MEGA軟件繪制，計算方法采用Neighbor-joining方法[9]。

2 結果與分析

2.1 PVY陽性植株的鑒定

經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽性植株分別編號為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。

2.2 PVY CP基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取陽性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結果見圖1，泳道1、2均為PVY陽性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉錄為模板進行PVY CP基因的RT-PCR擴增，結果見圖2。由圖2可知，11個樣品擴增出了801 bp的目標片段，與預期大小一致，表明成功擴增出了CP基因。

2.3 PVY CP基因的生物信息學分析

11個樣品PVY分離株 CP基因的序列與GenBank 上已公布的PVY 不同分離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達99.4%。根據(jù)Potyvirus 病毒劃分種的標準，當CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時，應歸為同一個種。因此，11個分離株應為PVY分離株。

11個分離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計57個位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒有發(fā)生變化，編碼267個氨基酸序列，造成16個氨基酸序列存在變異（圖3）。

該地區(qū)PVY的親緣關系見圖4。由圖4可知，11個分離株可分為4類。第一類PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個不同省份PVY分離株（圖4中藍色框標識部分）聚類到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說明在本地區(qū)馬鈴薯長期種植過程中，PVY病毒進化有別于其他省份分離得到的病毒株系，發(fā)展成為較新的一類型。第二類PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類同屬于PVY O型這一進化分枝；第三類PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之間。第四類PVY35，與本次分離得到的其他株系關系較遠，同源性僅為93%，因此，將此分離株CP基因序列注冊GenBank，登入號為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。

2.4 寧夏地區(qū)PVY類型分析

在核苷酸水平根據(jù)PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35分離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余分離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)PVY CP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。分離株PVY35可能為PVYNTN型，其余分離株屬于PVY O型進化分枝。據(jù)此，推測寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVY O型進化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3種病毒類型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%（10/11），但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%（1/11）。

3 小結與討論

PVY不同株系間可能具有相同的血清型或生物學特性，單獨利用免疫學技術和接種鑒別寄主等方法均無法對各株系進行準確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測能很核苷酸水平準確檢測其基因型，這對快速掌握和防控PVY流行趨勢具有一定的指導意義。本研究設計的引物為擴增PVY CP基因全長序列，其能提供更多的分型位點，在一定程度上彌補了血清學檢測的不足。通過PVY通用型ELSIA試劑盒對寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進行檢測，共檢測出11株PVY分離株，對這些病毒的衣殼蛋白基因進行測序，可以劃分為4個類型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。

近20年來，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長的趨勢并偶有分布。高芳鑾等[10]對中國PVY病毒進行了CP基因變異研究，但沒有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測出PVY病毒11株，僅占整個檢測材料的5.64%，這個原因可能是由于多病毒復合感染，造成類似表型。

參考文獻：

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（責任編輯 屠 晶）endprint