富硒女貞子對(duì)奶牛血液指標(biāo)和HSP70的影響

曹 錚，湯里平，姚秋霞，楊云喬，尚秋辰，許小琴

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

奶牛熱應(yīng)激是一種主要由環(huán)境溫度和空氣濕度引起的全身適應(yīng)性綜合征，當(dāng)奶牛機(jī)體受到超過(guò)自身體溫調(diào)節(jié)能力的高溫高濕刺激時(shí)，其下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸（HPA 軸）和交感－腎上腺髓質(zhì)軸興奮，從而產(chǎn)生一系列非特異性應(yīng)答。

前期研究顯示：富硒女貞子可以有效降低急性熱應(yīng)激小鼠的死亡率；減少熱應(yīng)激造成的小鼠生長(zhǎng)抑制，提高其免疫力［5］；可有效的緩解熱應(yīng)激期間奶山羊的產(chǎn)奶量下降，增強(qiáng)奶山羊的抗氧化能力和免疫力；通過(guò)在熱應(yīng)激奶牛的日糧中添加富硒女貞子的研究發(fā)現(xiàn)，富硒女貞子高、中、低3個(gè)劑量組的奶產(chǎn)量較熱應(yīng)激前分別下降了23.91%、28.87%、25.23%，與普通女貞子組和熱應(yīng)激對(duì)照組分別下降的39.19%和36.55%有差異；飼喂中劑量富硒女貞子的試驗(yàn)2組和飼喂普通女貞子的試驗(yàn)4組的乳蛋白含量較熱應(yīng)激前也有提高。表明富硒女貞子具有良好的緩解熱應(yīng)激作用［6］。為進(jìn)一步探究富硒女貞子對(duì)奶牛生理健康的影響和緩解熱應(yīng)激的機(jī)制，進(jìn)行了如下試驗(yàn)觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)選擇年齡、胎次相同，產(chǎn)奶量相近的中國(guó)荷斯坦奶牛40頭，隨機(jī)分為4組，每組10頭，分別為：富硒女貞子高劑量組（1組）；富硒女貞子中劑量組（2組）；富硒女貞子低劑量組（3組）；普通女貞子組（4組）。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 女貞子均采自江蘇揚(yáng)州，并經(jīng)鑒定符合女貞子藥材特征。富硒女貞子，由揚(yáng)州大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室自制，通過(guò)女貞樹盛花期葉面噴施400mg／L濃度的亞硒酸鈉2次，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化法獲得硒含量為1.88μg／g的富硒女貞子果實(shí)［7］。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特公司），干濕溫度計(jì)，紅外線體溫計(jì)，TDZ4－WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀集團(tuán)），BC－2800VET 血常規(guī)分析儀（邁瑞mindray），Centrifuge5810R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），一次性負(fù)壓采血管（江蘇榮業(yè)科技有限公司），核酸蛋白濃度檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)環(huán)境 40頭試驗(yàn)用牛全部集中飼養(yǎng)在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)5號(hào)雙列牛舍中，每日上槽3次，時(shí)間分別是7∶00、15∶00和21∶00，各組基礎(chǔ)日糧相同，精料根據(jù)上1d與前3d產(chǎn)奶量平均數(shù)而定量。將干濕溫度計(jì)置于牛舍離地面1.5m高處，每天上午8∶00和下午15∶00讀取溫度和濕度，計(jì)算THI。

1.2.2 藥物處理 將富硒女貞子和女貞子用中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，富硒女貞子分裝為20g／包、40g／包、60g／包，女貞子分裝成40g／包。

1.2.3 試驗(yàn)條件和給藥方法 試驗(yàn)分兩個(gè)階段進(jìn)行：第一階段，2014年5月1日至2014年6月15日，各組均不給藥，觀察記錄每天的氣溫和濕度，計(jì)算THI，并于試驗(yàn)開始的第1、15、30、45d的上午8時(shí)上槽前每組隨機(jī)挑選6頭奶牛使用一次性負(fù)壓采血管進(jìn)行尾靜脈采血7 mL，其中2 mL 加入EDTA·K2抗凝管得到全血，5mL加入含有促凝劑的促凝管制備血清。全血在采血后2h內(nèi)使用血常規(guī)分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，血清使用EP 管分裝后置于－20 ℃保存，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)。

第二階段，2014年7月21日至2014年9月1日，于每旬的前三天下午15時(shí)給藥，每日一次。給藥劑量分別為1組60g／頭／d、2組40g／頭／d、3組20g／頭／d富硒女貞子粉，4組40g／頭／d普通女貞子粉。每天觀察記錄氣溫和濕度，并于試驗(yàn)開始的第1、15、30、45d的上午8時(shí)上槽前每組隨機(jī)挑選6頭奶牛使用一次性負(fù)壓采血管進(jìn)行尾靜脈采血7mL，將2 mL 加入到EDTA·K2抗凝管得到全血，5mL加入到含有促凝劑的促凝管制備血清。全血在采血后2h內(nèi)使用血常規(guī)分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，血清使用EP管分裝后置于－20℃保存，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)。

2.3.3 水源管理∶苗木扦插后當(dāng)天對(duì)苗圃地及時(shí)上水是苗木成活的決定因子，注水采用灌注，第一次上水一定要足，以苗床表面有水為止；三天后第二次上水仍以苗床表面有水為度，讓土壤吸足水分后風(fēng)化；相隔5天后第三次上水，以苗床平水為度，以后灌溉以一個(gè)星期左右為宜，視天氣情況而定，成活前只要保證苗圃地濕潤(rùn)為宜。

1.2.4 血常規(guī)和血清生化檢測(cè) 血常規(guī)指標(biāo)：使用BC－2800VET 血常規(guī)分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（Lymph）、血紅蛋白（HGB）含量4個(gè)指標(biāo)。

血清指標(biāo)：使用ELISA 試劑盒檢測(cè)促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（Cortisol）、三碘甲腺原氨酸（T3）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、熱應(yīng)激休克蛋白（HSP70）、白介素6（IL－6）、γ－干擾素。試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛舍環(huán)境統(tǒng)計(jì)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間每3d 的平均氣溫和濕度計(jì)算THI，由圖1可以看出，7月21日到9月1日期間THI明顯高于5月1日到6月15日這段時(shí)間，且均高于72，表明奶牛在7月21日到9月1日期間一直處于熱應(yīng)激狀態(tài)。5月1日到6月15日期間，THI均在70以下，因此將第一階段試驗(yàn)作為第二階段試驗(yàn)的對(duì)照。

圖1 牛舍溫濕指數(shù)變化曲線圖Fig.1 Changing curve of THI in cowshed

2.2 富硒女貞子對(duì)奶牛血常規(guī)指標(biāo)的影響

從表1知，熱應(yīng)激期間（7.21～9.1）各組的的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈下降趨勢(shì)，但試驗(yàn)1、2兩組與5.1到6.15期間的數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），3組顯著下降（P＜0.05）。組與組之間，試驗(yàn)1組和2 組顯著高于其他各組（P＜0.05）。

2.3 富硒女貞子對(duì)奶牛內(nèi)分泌指標(biāo)的影響

從表2知，熱應(yīng)激早期（用藥前，7.21）ACTH含量上升，各組ACTH 水平自用藥后（8.4）開始均有下降，其中試驗(yàn)1 組各時(shí)間段無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)2、3、4組下降差異顯著，其中試驗(yàn)2組的9.4數(shù)據(jù)較7.21數(shù)據(jù)有極顯著下降（P＜0.01）。

表1 奶牛血常規(guī)測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of routine blood examination of dairy cows

表2 奶牛血清內(nèi)分泌指標(biāo)測(cè)定結(jié)果table 2 Results of endocrine index of dairy cattle

奶牛血清中的皮質(zhì)醇含量在慢性熱應(yīng)激狀態(tài)下由于ACTH 的上升而上升，從表2知，試驗(yàn)1、3組在熱應(yīng)激期間（7.21～9.1）皮質(zhì)醇含量無(wú)顯著變化（P＞0.05）。試驗(yàn)2組用藥后（8.4）皮質(zhì)醇水平開始降低，較熱應(yīng)激初期（7.21）差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)4組的皮質(zhì)醇水平顯著升高（P＜0.05）。

在熱應(yīng)激早期（7.21），各組奶牛血清中T3 水平均較非熱應(yīng)激期間有大幅下降，其中1、3、4組差異顯著（P＜0.05）。用藥之后，各組的T3水平均有所上升，其中試驗(yàn)1，2、4組與在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（THI＞75）恢復(fù)到正常時(shí)（THI＜70）的T3水平，試驗(yàn)3組的T3水平上升后下降，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍有顯著低于正常值（P＜0.05），藥效果不明顯。

2.4 富硒女貞子對(duì)血清中熱休克蛋白含量的影響

從表3可看出，各組均能增加熱應(yīng)激狀態(tài)的奶牛血清中HSP70的含量，其中試驗(yàn)1、2組HSP70在用藥后含量最高，與其他各組有顯著差異（P＜0.05）。從時(shí)間上比較，試驗(yàn)1、2組HSP70水平均呈上升趨勢(shì)，但1 組各個(gè)時(shí)間段無(wú)顯著差異（P＜0.05），2組較喂藥前（7.21）有顯著提高（P＜0.05）。

2.5 富硒女貞子對(duì)奶?？寡趸阅艿挠绊?/h3>

從表4知，在試驗(yàn)過(guò)程中各組的SOD 值均有所上升，其中試驗(yàn)2組和4組差異顯著（P＜0.05），其他各組均無(wú)顯著差異。

表4 中GSH－PX 的結(jié)果顯示，在熱應(yīng)激狀態(tài)中，奶牛血清中的GSH－PX 含量會(huì)下降（5.1～6.15和7.21 比）。在熱應(yīng)激期間試驗(yàn)2 組和4 組的GSH－PX含量較喂藥前（7.21）有顯著提高（P＜0.05）。其他各組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 奶牛血清中HSP70測(cè)定結(jié)果table 3 Effects of se－enriched ligustrum lucidum fruits on HSP70of dairy cattle

表4 奶?？寡趸阅軠y(cè)定結(jié)果table 4 Results of antioxidant capacity examination of dairy cattle

2.6 富硒女貞子對(duì)奶牛免疫指標(biāo)的影響

從表5可以看出，用藥之后（7.22）奶牛血清中白介素6水平均呈上升趨勢(shì)，其中除試驗(yàn)2組、4組外均有上升（P＜0.05）。組間比較可以看出，在8月18日時(shí)試驗(yàn)2、3 兩組IL－6 含量高于試驗(yàn)1、4組，但差異不顯著（P＜0.05）。

從表4可看出，奶牛血清中IFN－γ水平在7月21日后，試驗(yàn)1、2、4組均迅速上升，均較5.1～6.15數(shù)據(jù)有顯著提高（P＜0.05），其中試驗(yàn)2組差異極顯著（P＜0.01），試驗(yàn)3組用藥后IFN－γ水平較用藥前有所上升，但差異不顯著（P＞0.05）。

表5 奶牛免疫指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果table 5 Results of immune indices examination of dairy cattle

3 討論

奶牛所經(jīng)歷的環(huán)境和管理?xiàng)l件（如過(guò)熱、擁擠、運(yùn)輸、接種疫苗等）具有激活下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)（HPA）軸和交感－腎上腺髓質(zhì)軸的潛在能力，這些條件被稱為應(yīng)激物［8］。在本次試驗(yàn)中，熱應(yīng)激時(shí)（7.22）各組的ACTH 和皮質(zhì)醇水平較正常狀態(tài)（5.1～6.15）下為高，而T3 水平有所降低，與蔡亞非等［9］和Selberg等［10］對(duì)荷斯坦奶牛的研究結(jié)果相一致，這是因?yàn)楦邷刈鳛閼?yīng)激物使HPA 軸興奮，使促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素（CRH）分泌增加，從而使ACTH 分泌亦增加，皮質(zhì)醇受ACTH 調(diào)節(jié)上升［11］。與此同時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)自身調(diào)節(jié)降低代謝率以降低代謝熱，所以，在熱應(yīng)激期間奶牛的T3 水平有所下降。在用藥后（8.4、8.18、9.1）各組的ACTH 水平均有所下降，其中試驗(yàn)2組效果最為明顯，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)較熱應(yīng)激期間有極顯著下降。皮質(zhì)醇方面，在用藥后除試驗(yàn)4組外各組均無(wú)顯著差異。表明富硒女貞子和女貞子具有通過(guò)降低ACTH 水平而調(diào)節(jié)奶?？篃釕?yīng)激的功能。

1957年，Schwarz［12］發(fā)現(xiàn)硒是哺乳動(dòng)物所必需的營(yíng)養(yǎng)素，改變了此前人們對(duì)硒的看法。1973年Rotrku［13］的研究發(fā)現(xiàn)硒是GSH－Px 的組成成分。GSH－Px可以在生物體內(nèi)催化氫過(guò)氧化物或脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)樗虼碱悾杂苫鶎?duì)生物膜的攻擊，保護(hù)生物膜免受氧化損傷。硒能夠調(diào)節(jié)維生素C、維生素E 的吸收和利用。且硒能夠改善奶牛的瘤胃內(nèi)環(huán)境使乙酸、丙酸、丁酸及揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的總產(chǎn)量同時(shí)提高［14］。試驗(yàn)中各組在熱應(yīng)激早期（7.21.～8.4）SOD 和GSH－Px 水平均下降，與宋小珍等［15］觀察到熱應(yīng)激期間錦江黃牛的SOD 和GSH－Px水平下降的結(jié)果相一致。這主要是由于熱應(yīng)激使奶牛的交感－腎上腺系統(tǒng)興奮從而導(dǎo)致腎上腺髓質(zhì)大量分泌兒茶酚胺類激素使自由基產(chǎn)生量增加，進(jìn)而產(chǎn)生組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，使體內(nèi)儲(chǔ)備的酶類和非酶類抗氧化劑因消耗過(guò)多而水平下降［16］。用藥后試驗(yàn)2組和4組的SOD 和GSHPx水平均有上升（P＜0.05），且試驗(yàn)2組的GSHPx水平較4組為高。表明富硒女貞子和女貞子具有良好的提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化性的能力，且中劑量富硒女貞子作用更好。

由熱應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱應(yīng)激蛋白（HSPs）通過(guò)分子伴侶作用參與蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞保護(hù)、抗原遞呈及腫瘤免疫等許多重要體內(nèi)過(guò)程。熱應(yīng)激蛋白按分子量大小可以分為HSP100、HSP90、HSP 70、HSP60及小分子HSP，其中被研究最多也最為重要的是HSP70家族。真核生物HSP70的轉(zhuǎn)錄需要通過(guò)：熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）的激活，HSF 與熱應(yīng)激元件（HSE）的組合，HSP70基因的轉(zhuǎn)錄三個(gè)步驟。正常狀態(tài)下HSF 與HSP70 結(jié)合，不具有與HSE結(jié)合的能力，在應(yīng)激條件下，損傷的蛋白與HSP70競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使HSF游離出來(lái)結(jié)合HSE 促進(jìn)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄［17］。在翻譯時(shí)，HSP70 mR NA 通過(guò)增強(qiáng)穩(wěn)定性和優(yōu)先翻譯來(lái)保證機(jī)體的需要。許生友等［18］在研究熱應(yīng)激期間肉雞肝臟和下丘腦HSP70mRNA 表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物剛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)HSP70mRNA 的表達(dá)量上升，隨著熱應(yīng)激時(shí)間的增長(zhǎng)，表達(dá)量迅速下降，表明高溫超出了動(dòng)物本身的調(diào)節(jié)能力。本次試驗(yàn)中，在用藥前（7.21）HSP70含量較正常時(shí)期有大幅下降，用藥后開始回升，這與張洪德等［19］使用白虎湯加減進(jìn)行的研究結(jié)果相似。

應(yīng)激對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制性影響目前受到了人們的廣泛重視，其中包括淋巴細(xì)胞活性降低，干擾素產(chǎn)生減少，吞噬作用降低，NK 細(xì)胞活性減低，輔助性T 細(xì)胞和抑制性T 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及比率降低，唾液IgA 水平降低等［20］。應(yīng)激與免疫是通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相聯(lián)系的，應(yīng)激引起HPA 軸反應(yīng)，導(dǎo)致各種激素分泌亢進(jìn)，這些激素作用于細(xì)胞因子，從而影響免疫功能。胡艷欣等［21］對(duì)熱應(yīng)激后豬血清的IFNγ測(cè)定結(jié)果表明，熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)IFN－γ分泌量大幅下降。本次試驗(yàn)中，用藥后IL－6與IFN－γ水平能顯著上升，表現(xiàn)出了富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激的免疫系統(tǒng)抑制性影響有較好的治療效果。

4 小結(jié)

試驗(yàn)證明富硒女貞子可以改善內(nèi)分泌，有效地降低ACTH 和皮質(zhì)醇水平，升高T3 水平；誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，使血清中HSP70的水平升高；增強(qiáng)抗氧化能力，使SOD 和GSH－Px活性升高；提高IL－6和IFN－γ表達(dá)量，增加免疫力。通過(guò)這些途徑來(lái)緩解、治療奶牛的熱應(yīng)激反應(yīng)。但是，進(jìn)一步分析試驗(yàn)結(jié)果看出，富硒女貞子60、40、20g／頭／d的劑量的作用效果在不同觀察指標(biāo)間存在一定的差異，其最佳劑量、療程還有待進(jìn)一步研究；富硒女貞子中發(fā)揮這些作用效果的有效成分亦有待探討。

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