云南普洱瓢雞、騰沖雪雞GRX1、TRX1基因差異性表達(dá)

李美荃，宋 聰，張春勇，安清聰，潘洪斌，陳克嶙，郭榮富

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201）

在云南高原立體環(huán)境下，自繁自養(yǎng)的本地雞種通過(guò)生物進(jìn)化形成了獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)特性。云南地方雞種肉香味美、肉質(zhì)細(xì)嫩，抗病力強(qiáng)，抗氧化特性較培育雞種高。謝強(qiáng)明等研究報(bào)道，普洱瓢雞生長(zhǎng)在海拔較高、氣候冷涼的山區(qū)，具有體型矮小細(xì)致的體征特點(diǎn)，瓢雞腹脂較厚、易于沉積脂肪，肉味細(xì)嫩鮮美［1］。沈雪鷹等調(diào)查報(bào)道，騰沖雪雞產(chǎn)于冬季積雪的高黎貢山西麓，羽毛潔白、肉骨烏黑，肉質(zhì)鮮美香甜，騰沖雪雞對(duì)一般疾病如雞白痢、球蟲(chóng)病有較強(qiáng)的抵抗力，是我國(guó)地方優(yōu)良雞種［2］。谷氧還蛋白（glutaredoxin，GRX）和硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）是抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)的重要成員，在抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，具有維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)、抗衰老及腸道保護(hù)生物學(xué)效應(yīng)等作用［3］。Lundberg等［4］報(bào)道，GRX 家族逐漸擴(kuò)大，新的GRX 成員不斷被發(fā)現(xiàn)，如谷氧還蛋白1（GRX1）、谷氧還蛋白2（GRX2）。Kim M J等研究報(bào)道，1型半胱氨酸的cMsrA 是通過(guò)GRX 再生的［5］。目前在硫氧還蛋白家族（TRXs）中，主要有TRX1 和TRX2兩型，在細(xì)胞抗氧化能力方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)旨在探討不同雞種間抗氧化基因的差異，為提高其抗氧化能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)以云南特有同日齡健康普洱瓢雞、騰沖雪雞為研究對(duì)象，以三黃雞為試驗(yàn)對(duì)照，相同日糧和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，雞場(chǎng)實(shí)施正常免疫程序和飼養(yǎng)管理。每個(gè)試驗(yàn)雞種各隨機(jī)取12只體重相近的雞（1／2♂；1／2♀），共36只試驗(yàn)雞屠宰備用。

1.2 樣品收集

采用頸部錯(cuò)位法屠宰試驗(yàn)雞，屠宰后立即取其十二指腸、回腸、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、皮膚、肌肉共八個(gè)組織，于－80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT－PCR

1.3.1 不同品種雞組織總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄使用TRIzol法提取組織RNA（按照說(shuō)明書(shū)操作），并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法和分光光度計(jì)檢測(cè)法進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。采用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA 置于－20 ℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) RT－PCR 擴(kuò)增引物根據(jù)Gen－Bank提供的mRNA 序列使用Primer Premier（5.0）軟件設(shè)計(jì)，如表1所示。由上海生工生物工程設(shè)計(jì)服務(wù)有限公司合成。

表1 qRT－PCR引物信息Table 1 Information of Primers used for qRT－PCR

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Eva GreenⅠ染料法，反應(yīng)在Bio－Rad CFX96TM Real－Time PCR Systems上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL：SsoFastTM EvaGREEN○RSupermix 10μL（BIO－RAD，美國(guó)），上下游引物（10μmol／L）各1.0μL，cDNA 模板2.0 μL，加滅菌去離子水至20μL。樣品分裝于96孔板（BIO－RAD，美國(guó)）中，可透光蓋（BIO－RAD，美國(guó)）蓋緊。TRX1反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min；95 ℃、5s，57 ℃、20s，72 ℃、15s，40個(gè)循環(huán)。GRX1反應(yīng)條件為：95 ℃，10min；95 ℃、5s，59 ℃、20s，72 ℃、15s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有組織低氧適應(yīng)基因的表達(dá)量均是以GAP－DH、18s、β－actin為內(nèi)參基因，最終以相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示，相對(duì)熒光定量計(jì)算方法采用Pfaffl M.W.［6］方法計(jì)算而來(lái)。所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRX1與GRX1品種間基因表達(dá)差異

普洱瓢雞、騰沖雪雞所有組織的TRX1、GRX1基因mRNA 表達(dá)量高于三黃雞，普洱瓢雞大部分組織的TRX1、GRX1基因mRNA 表達(dá)量高于騰沖雪雞（圖1）。

圖1 普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞TRX1（a），GRX1（b）基因的差異表達(dá)Fig.1 Difference of TRX1（a），GRX1（b）gene expression in Puerpiao，Tengchongxue and Sanhuang chicken

2.2 TRX1與GRX1組織間基因表達(dá)差異

普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞所有組織中TRX1基因mRNA 表達(dá)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GRX1基因mRNA表達(dá)量（如圖2 所示）。其中，腎臟中的TRX1、GRX1表達(dá)差異最為顯著（P＜0.01）。普洱瓢雞組織的TRX1基因mRNA 表達(dá)量最高的是腎臟和肝臟，表達(dá)量最低的是心臟和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。普洱瓢雞組織的GRX1 基因mRNA 表達(dá)量最高的是肺臟和肝臟，表達(dá)量最低的是心臟和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。騰沖雪雞組織的TRX1基因mRNA 表達(dá)量最高的是腎臟和肺臟，表達(dá)量最低的是回腸和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。騰沖雪雞組織的GRX1 基因表達(dá)量最高的是肝臟和十二指腸，表達(dá)量最低的是肌肉和心臟，差異極顯著（P＜0.01）。三黃雞組織的TRX1 基因mRNA表達(dá)量最高的是腎臟和肺臟，表達(dá)量最低的是回腸和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。三黃雞組織的GRX1基因mRNA 表達(dá)量最高的是十二指腸和回腸，表達(dá)量最低的是皮膚和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

3.1 TRX1、GRX1的抗氧化應(yīng)激生物學(xué)效應(yīng)

細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞分化、細(xì)胞免疫、生長(zhǎng)抑制、腫瘤發(fā)生以及凋亡密切相關(guān)［7］。GRX 是由Holmgren等在缺失TRX 基因的大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)的，是一類依賴GSH 的氧化還原酶，在細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的調(diào)控及抵抗氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用［8］。TRX 于1964年在大腸桿菌中首次被發(fā)現(xiàn)，是一種內(nèi)生的抗氧化劑，在組織的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶被耗盡后可能發(fā)揮關(guān)鍵性作用［9］。GRX 和TRX 在細(xì)胞分化、細(xì)胞免疫、生長(zhǎng)抑制、腫瘤以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的抗氧化作用［10］。

圖2 普洱瓢雞TRX1、GRX1（a）、騰沖雪雞TRX1、GRX1（b）、三黃雞的TRX1、GRX1（c）基因表達(dá)差異Fig.2 Difference of GRX1and TRX1gene expression for Puerpiao（a），Tengchongxue（b），Sanhuang（c）chicken

3.2 TRX1、GRX1基因在不同品種間的差異表達(dá)

本地雞種普洱瓢雞、騰沖雪雞的TRX1、GRX1含量顯著高于三黃雞；而云南地方雞種騰沖雪雞和普洱瓢雞之間，其TRX1、GRX1的含量與普洱瓢雞也存在差異，普洱瓢雞大部分組織的TRX1、GRX1基因mRNA 表達(dá)量高于騰沖雪雞。普洱瓢雞生長(zhǎng)在海拔較高、氣候冷涼的山區(qū)，由于長(zhǎng)期處于小群封閉、自繁自養(yǎng)狀態(tài)，沒(méi)有外來(lái)雞種的混雜，通過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇而成。騰沖雪雞產(chǎn)于山頂常年積雪的高黎貢山西麓，是云南省優(yōu)良地方雞種資源［11］。由于云南高海拔低氧氣候，地方雞種為了適應(yīng)缺氧環(huán)境故其抗氧化能力強(qiáng)于培育雞種三黃雞。

3.3 TRX1與GRX1基因表達(dá)差異

GRX 作用于抗氧化酶系統(tǒng)，TRX 作用于抗氧化非酶系統(tǒng)［12］。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶物質(zhì)大都屬于大分子物質(zhì)，非酶系統(tǒng)主要包括維生素C、谷胱甘肽等小分子物質(zhì)［13］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞所有組織的TRX1基因的mRNA表達(dá)量比GRX1 基因的mRNA 表達(dá)量高，但動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)作用機(jī)理復(fù)雜，因此并不能說(shuō)明動(dòng)物機(jī)體內(nèi)TRX1 的抗氧化作用大于GRX1。TRX1和GRX1的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.4 TRX1、GRX1基因在不同組織間表達(dá)差異

腎臟是對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感的器官之一，ROS對(duì)腎臟有直接的損傷作用。細(xì)胞中的活性氧是導(dǎo)致生物氧化脅迫的一個(gè)主要方面。而TRX 與硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及NADPH 共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng)參與眾多生理過(guò)程［14］。TRX 可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)被氧化的二硫鍵的還原來(lái)修復(fù)機(jī)體的氧化損傷［15］。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)通過(guò)大量表達(dá)TRX1 使腎臟免于氧化應(yīng)激損傷［16］。Sugama K 等報(bào)道TRX 與腎小管損傷有關(guān)，且影響IL－10水平［17］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞的腎臟內(nèi)的TRX1 含量高于其他組織，而GRX1表達(dá)與其他組織差異不明顯，可說(shuō)明在腎臟內(nèi)參與抗氧化的蛋白質(zhì)主要是TRX。大量ROS產(chǎn)生會(huì)造成組織細(xì)胞的損害，而肺臟是最易受損的靶器官之一。其中ROS可與蛋白質(zhì)中的色氨酸、組氨酸和半胱氨酸等殘基反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能，使含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)、酶和受體等功能受損［18］。GRX 催化依賴谷胱甘肽的二硫化物氧化還原過(guò)程，通常發(fā)生在GRX 上被其他氨基酸隔開(kāi)的兩端半胱氨酸上［19］，半胱氨酸的表達(dá)直接影響谷氧還蛋白的表達(dá)與作用。ROS引起的肺損傷攻擊半胱氨酸，導(dǎo)致谷氧還蛋白表達(dá)低。Cao等研究報(bào)道，GGA 能夠保護(hù)由TRX 引起的肺臟缺血再灌注損傷［20］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，瓢雞的GRX1表達(dá)高于雪雞與三黃雞的，與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果相一致，瓢雞肺臟受ROS攻擊最小。為了維持肺臟的基本功能和氧化還原平衡，抵制ROS對(duì)半胱氨酸的攻擊，故而肺臟的GRX1含量相較其他組織要高。

肝臟在代謝過(guò)程中可不斷產(chǎn)生一些氧化活性物質(zhì)（ROS）。肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)有四類：酶促防御機(jī)制、硫氧化還原蛋白和過(guò)氧化還原蛋白、低分子量的抗氧化劑和金屬結(jié)合蛋白［21］。谷氧還蛋白系統(tǒng)主要存在于胞漿和線粒體中，硫氧還蛋白還原系統(tǒng)主要存在于包漿中。故而肝臟的GRX1、TRX1表達(dá)較之其他組織要高很多，其在氧化還原中具有重要意義。Qin 等報(bào)道，高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷，TRX／TrxR 系統(tǒng)是其產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要因素［22］。

腸道是動(dòng)物消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能性器官，同時(shí)它還具有內(nèi)分泌、免疫、粘膜屏障等作用［23］。同時(shí)腸道是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，腸道系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)通常會(huì)降低畜禽機(jī)體的抗氧化能力，從而引起某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收障礙，尤其是在脂溶性維生素的吸收方面［24］。腸粘膜本身含有高濃度的非蛋白質(zhì)巰基，自由基作用于巰基導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶失活，自由基還能與膜內(nèi)的多不飽和脂肪酸結(jié)合造成脂質(zhì)過(guò)氧化損害［25］。因此，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，腸道是極易造成過(guò)氧化損傷的器官之一。與其他器官相比，腸道的GRX1、TRX1表達(dá)量相對(duì)較低也顯示腸道的過(guò)氧化損傷相對(duì)較嚴(yán)重。

4 結(jié)論

普洱瓢雞的GRX1、TRX1基因mRNA 表達(dá)水平高于騰沖雪雞，騰沖雪雞的GRX1、TRX1 基因mRNA 表達(dá)水平顯著高于三黃雞。普洱瓢雞、騰沖雪雞各組織中的TRX1、GRX1的表達(dá)量均高于三黃雞；TRX1 在三個(gè)雞種中的表達(dá)量顯著高于GRX1，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］謝強(qiáng)明，楊柳平.普洱瓢雞資源調(diào)查報(bào)告［J］.云南畜牧獸醫(yī)，2009，（4）：17－18.

［2］沈雪鷹，尹玉安.騰沖雪雞資源調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)家禽，1999，21（2）：8－9.

［3］黃金昌，郭榮富.谷氧還蛋白和硫氧還蛋白對(duì)動(dòng)物抗氧化應(yīng)激生物學(xué)效應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22（4）：845－850.

［4］Lundberg M，Johansson C，Chandra J，et al.Cloning and expression of a novel human glutaredoxin（GRX2）with mitochondrial and nuclear isoforms［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276（28）：26 269－26 275.

［5］Kim M J，Jeong J，Jeong J，et al.Mechanism of 1－Cys type methionine sulfoxide reductase A regeneration by glutaredoxin.Biochem Biophys Res Commun［J］.2015，457（4）：567－571.

［6］Pfaffl M W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic acids research，2001，29（9）：45.

［7］Holmgren A.Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside－diphosphate reductase dependent upon glutathione［J］.PNAS，1976，73（7）：2 275－2 279.

［8］Daily D，Vlamis－Gardikas A，Offen D，et al.Glutaredoxin protects cerebellar granule neurons from dopamine－induced apoptosis by activating NF－kappa B via Ref－1［J］.J Biol Chem，2001，276（2）：1 335－1 344.

［9］Powis G，Montfort W R.Properties and biological activities of thioredoxins［J］.Annu Rev Biophys Biomol Struct，2001，30（1）：421－455.

［10］Damdimopoulos A E，Miranda－Vizuete A，Pelto－Huikko M，et al.Human mitochondrial thioredoxin.Involvement in mitochondrial membrane potential and cell death［J］.J Bio Chem，2002，277（36）：33 249－33 257.

［11］李久強(qiáng).騰沖雪雞生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)［J］.當(dāng)代畜牧，2012（5）：3.

［12］Haapasalo H，Kylaniemi M，Paunul N，et al.Expression of antioxidant enzymes in astrocytic brain tumors［J］.Brain Pathol，2003，13（2）：155－164.

［13］Van Laer A，Dallalio G，McKenzie S W，et al.Thioredoxin and protein nitrotyrosine in bone marrow supermatant from patients with human immunodeficiency virus infection［J］.J Investing Med，2002，50（1）：10－18.

［14］Yoo C W，Song C Y，Kim B C，et al.Glycated albumin induces superoxide generation in mesangial cells［J］.Cell Physiol Biochem，2004，14（4－6）：361－368.

［15］Kitada M，Koya D，Isono M，et al.Translocation of glomerular p47phox and p67phox by protein kinase C－beta activation is required for oxidative stress in diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2003，52（10）：2 603－2 614.

［16］Gojo A，Uesunomiya K，Taniguchi K，et al.The Rho－kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin－induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2007，568（1－3）：242－247.

［17］Sugama K，Suzuki K，Yoshitani K，et al.Changes of thioredoxin，oxidative stress markers，inflammation and muscle／renal damage following intensive endurance exercise［J］.Exerc Immunol Rev，2015（21）：130－142.

［18］Hibi M，Lin A，Smeal T，et al.Identification of an oncoprotein－and UV－responsive protein kinase that binds and potentiates the c－Jun activation domain［J］.Genes Dev，1993，7（11）：2 135－2 148.

［19］Song J J，Lee Y J.Differential role of glutaredoxin and thioredoxin in metabolic oxidative stress－induced activation of apoptosis signal－regulating kinase 1［J］.Biochem J，2003，373（Pt 3）：845－853.

［20］Cao W，Li M，Li J，et al.Geranylgeranylacetone ameliorates lung ischemia／reperfusion injury by HSP70and thioredoxin redox system：NF－kB pathway involved［J］.Pulm Pharmacol Ther.2015，32（6）：109－115.

［21］Nobili V，Pastore A，Gaeta L M，et al.Glutathione metabolism and antioxidant enzymes in patients affected by nonalcoholic steatohepatitis［J］.Clin Chim Acta，2005，355（1－2）：105－111.

［22］Qin H，Zhang X，Ye F，et al.High－fat diet－induced changes in liver thioredoxin and thioredoxin reductase as a novel feature of insulin resistance［J］.FEBS Open Bio，2014，4（10）：928－935.

［23］Yesilova Z，Yaman H，Oktenli C，et al.Systemic markers of lipid peroxidation and antioxidants in patients with nonalcoholic Fatty liver disease［J］.Am J Gastroenterol，2005，100（4）：850－855.

［24］袁施彬，陳代文，余 冰，等.氧化應(yīng)激對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和養(yǎng)分利用率的影響［J］.中國(guó)飼料，2007（8）：19－22.

［25］Zheng P，Yu B，Lv M，et al.Effects of oxidative stress induced by Diquat on arginine metabolism of postweaning pigs［J］.Asian－Australian Journal of Animal Sciences，2010，23（1）：98－105.