宮頸癌術(shù)前動(dòng)脈灌注化療對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移的影響及可能機(jī)制的研究

張蕾 徐叢劍 姜樺

宮頸癌術(shù)前動(dòng)脈灌注化療已在臨床應(yīng)用了近半個(gè)世紀(jì)，其近期療效顯著，但遠(yuǎn)期療效仍存在爭(zhēng)議，至今仍未進(jìn)入FIGO推薦的治療方法中，其原因有待深入研究。淋巴轉(zhuǎn)移是影響遠(yuǎn)期療效的最重要因素，CD44是細(xì)胞黏附因子中與宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一種。其變異型CD44V6陽性者有如下表現(xiàn):血管浸潤(rùn)的發(fā)生明顯增加;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增加，受累數(shù)目增多;無復(fù)發(fā)生存期縮短，5年生存率下降［1，2］。本研究采用病史回顧性研究結(jié)合體外試驗(yàn)real-time PCR法測(cè)定宮頸癌Hela細(xì)胞CD44表達(dá)，初步推測(cè)宮頸癌術(shù)前灌注化療的遠(yuǎn)期療效存在爭(zhēng)議的原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2001至2007年復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院確診宮頸鱗癌(腺癌)Ⅰb～Ⅱb期患者722例，年齡24～73歲，平均年齡41.6歲。宮頸癌分期按FIGO(2000年)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法 對(duì)722例宮頸癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，按FIGO(2000年)分期，Ⅰb期543例，Ⅱa期139例，Ⅱb期40例。按其不同治療方式分為先行術(shù)前動(dòng)脈灌注再行手術(shù)組與直接手術(shù)組。術(shù)前灌注化療后再行手術(shù)患者186例。動(dòng)脈灌注化療藥物中，使用順鉑+長(zhǎng)春新堿+吡柔比星方案5例;PVB(順鉑+長(zhǎng)春新堿+博萊霉素)方案2例;順鉑+表阿霉素+博萊霉素方案179例。動(dòng)脈灌注化療1次165例，2次者20例，動(dòng)脈灌注化療后加用化療一次1例。直接手術(shù)組536例。術(shù)前動(dòng)脈灌注化療后1個(gè)月手術(shù)。手術(shù)方式均為廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃(伴或不伴雙附件切除)。

1.3 短時(shí)間的順鉑作用Hela細(xì)胞后對(duì)其細(xì)胞黏附因子CD44表達(dá)的影響

1.3.1 主要儀器與試劑:GeneAmp system PCR2400(美國(guó)PE公司產(chǎn)品);Thermal Cycler Dice Real Time System擴(kuò)增議(Perkin Elmer公司，美國(guó));PCR儀(Perkin Elmer公司，美國(guó));順鉑(SIGMA公司產(chǎn)品);RNAiso Reagent(Takara公司);real-time試劑(SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Takara公司)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)合成 CD44引物由 TaKaRa公司設(shè)計(jì)，序列如下:正義引物 5’-GCTTCCAGAGTTACGCCCTTGA-3，反義引物 5’-AACCCTTGCAACATTGCCTGA-3;內(nèi)參照β-actin正義引物 5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，反 義 引 物 5’-CAAACATGATCT GGGTCATCTTCTC-3’。

1.3.3 選取順鉑濃度:用四氮唑鹽法(MTT法)檢測(cè)不同濃度含順鉑培養(yǎng)液(0 mmol/L，0.005 mmol/L，0.05 mmol/L，0.5 mmol/L，5 mmol/L)在不同時(shí)間(4.5 h，9 h，18 h，36 h，72 h)作用下細(xì)胞活性。并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 分組:根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，取順鉑濃度0.05 mmol/L。將Hela細(xì)胞分3組進(jìn)行試驗(yàn)，分別為正常Hela細(xì)胞組、順鉑持續(xù)作用Hela細(xì)胞組、順鉑作用6 h后撤藥更換正常培液組。RNA提取時(shí)間點(diǎn)均采取0 h，4 h，8 h，16 h，24 h，32 h(順鉑作用 6 h 后撤藥組以撤藥時(shí)間為0點(diǎn))。

1.3.5 提取細(xì)胞RNA收集規(guī)定時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，PBS清洗沉淀，加入RNAiso Reagent 1 ml后勻漿，加入氯仿200 μl震蕩混勻后靜置，離心后取上層加入異丙醇。離心并將沉淀用75%乙醇洗滌再次離心后干燥，加DEPC水溶解。

1.3.6 總DNA純度鑒定 制備得到的RNA通過分光廣度儀測(cè)得 D260nm/D280nm 在1.8～2.1。

1.3.7 總cDNA合成 采用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒合成 cDNA，取總 RNA(所取量按 OD濃度)，加入 4 μl 5 × PrimeScript Buffer、1 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μl Oligo dT Primer、1 μl Random 6 mers，加 RNase Free dH2O 使總樣本體積達(dá) 20 μl。37℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s，置于－20℃冰箱保存。

1.3.8 實(shí)時(shí)定量熒光PCR取提取細(xì)胞及β-actin模版(cDNA 溶液)6 μl，加入 0.5 μl PCR Reverse Primer、0.5 μl PCR Forward Primer、12.5 μl SYBR Premix Ex Taq，加dH2O至樣本體積達(dá)25 μl。反應(yīng)過程:預(yù)變性Repeat 1 95℃ 10 s;PCR 反應(yīng) Repeat 40 95℃ 5 s、60℃30 s，反應(yīng)完畢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，用相對(duì)定量研究方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)擴(kuò)增曲線，確定每個(gè)基因相應(yīng)的 Ct值 ，進(jìn)行相對(duì)定量研究和統(tǒng)計(jì)處理。以β-actin為陽性內(nèi)對(duì)照基因，校正PCR模板的拷貝數(shù)。相對(duì)量采用2－ΔΔCt方法計(jì)算，即ΔCt目標(biāo)基因－Ct目標(biāo)基因 －Ct同一樣本 β-actin;ΔΔCt目標(biāo)基因=處理組 ΔCt目標(biāo)基因-對(duì)照組 ΔCt目標(biāo)基因 ，而相對(duì)倍數(shù) (Relative Quantification)=2－ΔΔCt目標(biāo)基因。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前動(dòng)脈灌注后手術(shù)與直接手術(shù)組脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率比較 Ⅱa期術(shù)前動(dòng)脈灌注組脈管內(nèi)癌栓率16.7%，低于直接手術(shù)組34.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)前動(dòng)脈灌注組總脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率17.7%，低于直接手術(shù)組27.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅰb期、Ⅱb期2組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 宮頸癌Ⅰb～Ⅱb患者脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率比較例(%)

2.2 術(shù)前動(dòng)脈灌注后手術(shù)與直接手術(shù)組淋巴轉(zhuǎn)移率比較 術(shù)前動(dòng)脈灌注組總淋巴轉(zhuǎn)移率16.1%，高于直接手術(shù)組9.9%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅰb期、Ⅱa、Ⅱb期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表 2。

表2 宮頸癌Ⅰb～Ⅱb患者淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生率比較 例(%)

2.3 短時(shí)間的順鉑作用Hela細(xì)胞后對(duì)其細(xì)胞黏附因子CD44表達(dá)的影響

2.3.1 目的基因及管家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線:目的基因與管家基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別以10倍等比稀釋(稀釋成6個(gè)濃度)后做定量PCR，所得到的Ct值與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值之間具有良好的線性關(guān)系，并擬合得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。CD44的相關(guān)系數(shù)為0.999，β-actin的相關(guān)系數(shù)為0.999。見圖1。

圖1 CD44和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 順鉑持續(xù)不同時(shí)間作用于Hela細(xì)胞后，殘留活細(xì)胞CD44表達(dá)的改變:共分為3組:正常不加順鉑的Hela細(xì)胞，順鉑持續(xù)作用的Hela細(xì)胞，順鉑作用6 h后撤藥的Hela細(xì)胞。在32 h內(nèi)定點(diǎn)測(cè)定其CD44表達(dá)，了解其改變趨勢(shì)。見表3～5。

表3 順鉑持續(xù)作用CD44表達(dá)量

表4 正常Hela細(xì)胞隨時(shí)間改變CD44表達(dá)

表5 順鉑作用6 h撤藥后CD44表達(dá)

2.3.3 CD44表達(dá)水平:順鉑持續(xù)作用組＜正常Hela細(xì)胞組＜順鉑作用6 h后撤藥組;Hela細(xì)胞黏附因子CD44分泌呈波動(dòng)性。正常Hela細(xì)胞CD44表達(dá)水平波動(dòng)較平緩;順鉑持續(xù)作用后，CD44表達(dá)波動(dòng)頻率增大;順鉑作用6 h后撤藥組，CD44表達(dá)波動(dòng)振幅最大。見圖2。

圖2 順鉑持續(xù)、短時(shí)作用CD44表達(dá)的比較

2.3.4 CD44和β-actin的溶解曲線及擴(kuò)增曲線:樣本及內(nèi)參的溶解曲線和增值曲線，非特異性增值少，且溶解峰均為單峰。試驗(yàn)具有穩(wěn)定性。見圖3。

3 討論

圖3 溶解曲線和增值曲線

宮頸癌的動(dòng)脈灌注化療作為一項(xiàng)新的有效治療宮頸癌的手段，在宮頸癌的治療中占著重要的地位。動(dòng)脈灌注化療是將抗癌藥物通過動(dòng)脈血管注入到靶器官，達(dá)到治療腫瘤的目的。其優(yōu)勢(shì)在于首過效應(yīng)，即當(dāng)抗癌藥物進(jìn)入體內(nèi)時(shí)首先接觸的組織器官優(yōu)先攝取藥物，從而產(chǎn)生最大的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn):(1)在灌注后組織藥物濃度方面:動(dòng)脈化療高于靜脈化療;(2)在用藥途徑方面:子宮動(dòng)脈化療優(yōu)于髂內(nèi)動(dòng)脈化療;(3)在用藥量方面:隨著抗癌藥物劑量的升高，癌組織內(nèi)抗癌藥物的量呈幾何倍數(shù)升高。動(dòng)脈灌注化療的近期療效已經(jīng)被多次證實(shí)，Kobayashi等［3，4］曾通過研究證明動(dòng)脈內(nèi)灌注化療前應(yīng)用能有效的縮小腫瘤。但在動(dòng)脈灌注化療的遠(yuǎn)期療效方面，卻沒有統(tǒng)一的結(jié)果。日本學(xué)者Takafumi Toita在97年曾行宮頸癌患者的流行病學(xué)調(diào)查，選取51例宮頸癌Ⅱb～Ⅳa行順鉑動(dòng)脈內(nèi)灌注化療及放療患者，結(jié)果顯示術(shù)前動(dòng)脈灌注化療對(duì)遠(yuǎn)期的療效并不明顯［6］。Kigawa 等［7，8］所作的研究也得到相同結(jié)果。但也有Yamakawa等［9］發(fā)現(xiàn)Ⅲb期介入后能手術(shù)者4年無瘤生存率75.2%，而放療僅為44.4%，差異顯著。以上研究得出了不同的結(jié)論，值得進(jìn)一步研究。

淋巴轉(zhuǎn)移是浸潤(rùn)性宮頸癌的主要擴(kuò)散方式。FIGO臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為宮頸癌預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。脈管內(nèi)癌栓是影響預(yù)后的一項(xiàng)重要因素，但不影響腫瘤的分期。所以本研究選取了淋巴轉(zhuǎn)移率來評(píng)估術(shù)前動(dòng)脈灌注化療的遠(yuǎn)期療效。同時(shí)，選取脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率，來評(píng)估術(shù)前動(dòng)脈灌注化療對(duì)局部腫瘤的療效。

從分析結(jié)果來看，術(shù)前動(dòng)脈灌注化療組的脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率相對(duì)于直接手術(shù)組總體脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率下降，Ⅱa期脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率下降，Ⅰb期與Ⅱb期無顯著性差異。各期淋巴轉(zhuǎn)移率無顯著性差異，總體淋巴轉(zhuǎn)移率上升。該結(jié)果提示術(shù)前動(dòng)脈灌注化療確實(shí)能局部縮小癌灶，因此能減少脈管內(nèi)癌栓的發(fā)生，但淋巴轉(zhuǎn)移率增加的結(jié)果，提示其對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移沒有作用，甚至增加了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［10］。這與其他學(xué)者所作的關(guān)于改善預(yù)后效果并不明顯的研究相符。2組Ⅱb期脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率和淋巴轉(zhuǎn)移率沒有顯著性差異可能與病例例數(shù)較少有關(guān)?；谶@個(gè)結(jié)果，本研究繼續(xù)行體外細(xì)胞試驗(yàn)，做進(jìn)一步研究。

細(xì)胞黏附因子(CAMs)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間或相互接觸和結(jié)合的一類因子，分布于細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞之間的黏附，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化等系列重要生理和病理的過程。CD44是在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用的細(xì)胞黏附因子，通過內(nèi)皮和內(nèi)皮下間質(zhì)來介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間的相互作用，表達(dá)于各種組織細(xì)胞中:淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，在宮頸癌的分化、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程中起重要的作用。對(duì)早期預(yù)測(cè)腫瘤的侵襲和評(píng)估預(yù)后是一種良好的指標(biāo)，已得到國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)。主要功能有:(1)參與淋巴細(xì)胞歸巢的過程;(2)參與淋巴細(xì)胞激活的過程;(3)與透明質(zhì)酸結(jié)合、介導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)間的粘連;(4)影響細(xì)胞遷移過程［9，11］?？膳c EGF受體HER2相互作用，致使細(xì)胞分裂增值失控，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。其表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的黏附能力成正比。

本研究旨在模擬宮頸癌術(shù)前灌注化療模式，選取目前動(dòng)脈灌注化療常用藥物順鉑，短時(shí)間作用于宮頸癌Hela細(xì)胞(6 h)后撤除藥物，與順鉑持續(xù)作用的Hela細(xì)胞及無藥物作用的Hela細(xì)胞比較，觀察其CD44黏附因子表達(dá)的改變。不加藥的正常Hela細(xì)胞CD44分泌水平隨時(shí)間改變變化不大，呈較穩(wěn)定趨勢(shì)。加入順鉑持續(xù)作用后，CD44表達(dá)水平下降，但分泌的波動(dòng)性增加，CD44水平并沒有隨藥物作用時(shí)間增長(zhǎng)而持續(xù)降低，呈波動(dòng)性穩(wěn)定在一個(gè)較低水平?？赡茼樸K作用后，殘留的細(xì)胞能穩(wěn)定在同一濃度順鉑環(huán)境下生長(zhǎng)，但數(shù)量被抑制，所以CD44水平雖然波動(dòng)，但仍維持在一個(gè)較低水平，且波動(dòng)存在一定節(jié)律性。當(dāng)順鉑作用6 h撤藥后，正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)的Hela細(xì)胞CD44水平明顯增高，波動(dòng)幅度增大，撤除藥物作用的宮頸癌細(xì)胞CD44的分泌呈反跳性的增高，黏附能力增強(qiáng)，此時(shí)的癌細(xì)胞更易于從原發(fā)灶脫落轉(zhuǎn)移，當(dāng)這部分癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，由于短時(shí)順鉑作用已經(jīng)消失，沒有后續(xù)藥物繼續(xù)作用，癌細(xì)胞活性恢復(fù)，在轉(zhuǎn)移處能穩(wěn)定生長(zhǎng)，增加了宮頸癌轉(zhuǎn)移的可能性。所模擬的術(shù)前灌注化療，可能正是由于一過性化療藥物作用于局部宮頸癌細(xì)胞后，導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞黏附因子分泌增加，轉(zhuǎn)移可能增大。該結(jié)果可能提示了術(shù)前灌注化療后，淋巴轉(zhuǎn)移率升高的原因。

本研究從臨床流行病學(xué)和體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)兩方面，初步證實(shí)了宮頸癌的術(shù)前灌注化療在縮小局部病灶的同時(shí)，可能會(huì)增加遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。提示臨床使用術(shù)前灌注化療，行手術(shù)后，可能仍需加用化療藥物治療。

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