蛋白激酶CK2α與食管癌發(fā)生發(fā)展及臨床病理因素的相關(guān)性研究

羅鳴 明幫春 駱志國 明星

食管癌在我國的發(fā)病率一直居高不下，其中常見類型為鱗癌。食管癌患者早期無明顯不適，不易引起重視，多數(shù)患者在出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難時才到醫(yī)院就診，此時疾病多已進(jìn)展到中晚期，癌癥多發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。食管癌的發(fā)生、進(jìn)展與多種基因表達(dá)異常有關(guān)，如CD47、miR-21、HER2等基因的高表達(dá)和 miR-133a、PTEN等基因的低表達(dá)，但這些基因仍不能完全闡釋食管癌的復(fù)雜［1］。因此，分子標(biāo)志物的探討一直是臨床診斷食管癌的重點。研究已證實，蛋白激酶CK2α在多種癌癥中表達(dá)量高，在癌癥發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2］。本文研究蛋白激酶CK2α對食管癌診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取本院收治的120例食管癌患者作為研究對象，其中男65例，女55例;年齡41～77歲，平均年齡(58±11)歲;臨床T分期:T1期0例、T2期5例、T3期26例、T4期89例;未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移102例、轉(zhuǎn)移18例;TNM分期:Ⅰ期11例、Ⅱ期51例、Ⅲ期58例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者均經(jīng)胃鏡活檢、病理證實為食管鱗癌;既往無腫瘤疾病史;初治患者;患者均按照UICC分期(1997)進(jìn)行臨床分期，分期中M1a是指胸上段食管癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胸下段食管癌腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):既往其他腫瘤病史者，近期使用化療或放療等抗腫瘤治療方式的患者，未進(jìn)行病例確診的患者。

1.3 儀器與試劑 陜西超英生物有限公司提供的組織芯片，編號為ESI202。該組織芯片可采集120點，包括食管癌和距腫瘤1.5 cm以內(nèi)的癌周組織。英國Abcam公司生產(chǎn)的CK2α單克隆抗體。美國Invitrogen公司生產(chǎn)的PCR試劑盒。江蘇碧云天公司提供組織蛋白抽提試劑盒;武漢谷歌公司提供WB制膠試劑盒;武漢博士德公司提供CK2α兔鼠二抗;ECL western印染發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司;OligodT與引物購自上海Invitrogen公司。

1.4 標(biāo)本采集 手術(shù)切除腫瘤組織、癌周組織和距離病灶5 cm及以上且沒有腫瘤細(xì)胞浸潤的組織，共9對，送檢病理室。

1.5 實驗方法 (1)免疫組化檢測食管癌組織內(nèi)CK2α抗體表達(dá):制備石蠟切片，使用二甲苯對組織切片脫蠟，且運用不同濃度乙醇脫水，在96℃下經(jīng)10%的檸檬酸(碧云天，中國)修復(fù)抗原。使用羊血清封閉非特異性抗原。CK2α抗體在4℃中孵育12 h，沖洗后加入酶標(biāo)兔鼠二抗，室溫孵育1 h，染色。(2)Westernblot檢測食管癌組織內(nèi)CK2α表達(dá):切下約20 μg的癌癥組織與相對應(yīng)的正常組織，根據(jù)蛋白抽提試劑盒說明書提取組織蛋白。通過BCA試劑盒定量所提取的蛋白，使用酶標(biāo)儀檢測蛋白純度與濃度，調(diào)節(jié)每份樣品的蛋白濃度，在－80℃下保存蛋白。采用WB制膠試劑盒(谷歌，中國)制作SDS聚丙烯酰胺凝膠，上樣緩沖液中加入等量的蛋白，煮沸，變性蛋白。電泳、轉(zhuǎn)膜，再運用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜非特異性抗原位點，加入CK2α抗體4℃過夜，PBST洗膜，ECL試劑顯色后，最終使用X線膠片顯影，計算機(jī)下分析膠片灰度值。實驗重復(fù)3次。(3)mRNA檢測:分離50 μg的食管癌組織與癌周組織，使用Trizol方法提取RNA，紫外分光光度計260/280鑒定樣品的濃度與質(zhì)量，電泳證實總RNA完整性。取5 μg總RNA，根據(jù)美國Invitrogen公司PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用PCR法測量mRNA。CK2α基因的引物設(shè)計序列如下:正義鏈序列為:5’-CGAGTTGCTTCCCGATAC-3’，反義鏈序列為:5’-CTCAGGGCTGACAAGGTG-3’。

1.6 免疫組化結(jié)果的評價標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，按照著色強(qiáng)度進(jìn)行分級，0分:無色;淡黃色:1分;棕黃色:2分，褐色:3分;顯微鏡下染色陽性細(xì)胞計數(shù):1% ～25%:1分;26% ～50%:2分;51%～75%:3分;＞75%:4分;兩個得分項目相加為最終評分，(－)為總分＜3分，陰性表達(dá);(+)為3分，弱陽性表達(dá);(++)為4分，中陽性表達(dá);(+++)為5分，強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，2組間計量資料采用2組獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗、等級資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果中食管癌組織與癌旁組織中的CK2α陽性細(xì)胞表達(dá)情況 食管癌組織中的CK2α中陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為35.83%、55.83%均高于癌旁組織的11.67%和0。兩種不同組織類型的CK2α表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。圖1A為食管癌組織中CK2α的中陽性表達(dá)，圖1B為食管癌組織中的 CK2α強(qiáng)陽性表達(dá)，圖1C為食管癌組織中CK2α的弱陽性表達(dá)，圖1D為癌旁組織的CK2α陰性表達(dá)。見表1、圖1。

表1 2組CK2α表達(dá)陽性率比較 n=120，例(%)

圖1 食管癌組織CK2α著色情況(免疫組化×40)

2.2 CK2α在食管癌組織中的表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 CK2α陽性表達(dá)情況與在不同T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，CK2α陽性表達(dá)分布在不同臨床TNM分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 CK2α在食管癌組織中的表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系例

2.3 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異 食管癌組織中的CK2α蛋白、CK2αmRNA表達(dá)均高于癌旁組織(P ＜0.05)。見表3、圖2。

表3 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異n=19，±s

表3 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異n=19，±s

組織類型 CK2α蛋白(灰度值) CK2αmRNA(RQ值)5.1 ±1.8 3.2 ±0.8癌旁組織 2.7 ±1.1 1.2 ±0.5 t值食管癌組織5.044 8.856 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖2 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異

3 討論

我國每年因食管癌的死亡的人群占所有癌癥死亡人的1/4。外科手術(shù)是食管癌的主要治療措施，癌細(xì)胞浸潤組織的范圍大小不同，其手術(shù)切除范圍和術(shù)后生存時間的長短差異較大，早期患者5年存活率約70%［3］。食管癌發(fā)病初期，癌細(xì)胞僅浸潤于黏膜或黏膜下層，此時期患者無明顯不適或者僅感到胸骨后刺痛、進(jìn)食哽噎感和反酸噯氣等輕微癥狀;當(dāng)患者因進(jìn)食困難、呼吸困難、聲音嘶啞、營養(yǎng)不良和體重下降等癥狀就診時，病情已進(jìn)展到中晚期，該時術(shù)后5年生存率為10% ～20%［4］。因此，食管癌的早期診斷具有重要意義。

目前，食管癌的主要診斷方法有CT、MRI等影像技術(shù)和病理組織學(xué)，其中病理組織學(xué)檢查結(jié)果是食管癌確診的根本依據(jù)。沒有特異的食管癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物可早期診斷食管癌。所有真核細(xì)胞中均含有蛋白激酶CK2，它具有多種生物功能，主要由2個催化亞基和2個調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成。CK2α屬于該蛋白激酶的催化亞基，是主要的功能基團(tuán)，主要作用是促使蛋白磷酸化，多種蛋白代謝過程中均有磷酸化底物的參與。

腫瘤的生長過程是癌細(xì)胞和宿主之間的相互作用的結(jié)果，與蛋白激酶CK2α促使蛋白磷酸化的功能有直接關(guān)系［5］。蛋白激酶CK2α可作為一種癌基因，可作為癌癥治療的一個可能靶點，它既可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、增殖，還具有誘導(dǎo)凋亡作用。機(jī)體內(nèi)多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)都需要蛋白激酶CK2α的參與，且在多種癌組織中高表達(dá)，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌等［6，7］。研究報道，頭頸部鱗癌組織中蛋白激酶CK2α的含量和活性明顯增多，增加程度與癌癥的侵襲性和預(yù)后間存在相關(guān)性［8］。蛋白激酶CK2α可能通過促使核受體輔阻遏物的磷酸化，阻止其泛素化而發(fā)生代謝分解，最終促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲［9］。食管癌組織中的CK2α中陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，提示蛋白激酶CK2α可能參與食管癌的發(fā)病。

喉癌細(xì)胞的凋亡過程中CK2α起到關(guān)鍵性作用，有可能作為該癌癥治療的分子靶點，另外，蛋白激酶CK2α與直腸癌的分期、分化和侵襲有關(guān)，可作為判斷直腸癌預(yù)后的一個指標(biāo)。因此，蛋白激酶CK2α可作為一些癌癥的腫瘤標(biāo)志物和評估患者預(yù)后的指標(biāo)。食管癌患者的預(yù)后與其TNM分期有著密切的關(guān)系，有研究報道，根據(jù)蛋白激酶CK2α的表達(dá)量可推測食管癌的進(jìn)展程度［10］，本研究顯示，食管癌組織中的CK2α蛋白表達(dá)和CK2αmRNA均顯著的高于癌旁組織，提示蛋白激酶CK2α可作為食管癌臨床分期的預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述，蛋白激酶CK2α與食管癌的發(fā)生和癌細(xì)胞侵襲存在重要的聯(lián)系，可以作為臨床上對食管癌病變程度的一種分子判定標(biāo)準(zhǔn)。本研究的不足之處在于樣本量小，說服力不夠，后續(xù)研究應(yīng)加大樣本，重復(fù)進(jìn)行體內(nèi)外實驗，進(jìn)一步證實蛋白激酶CK2α可作為食管癌病程進(jìn)展的預(yù)測指標(biāo)。

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