含L-精氨酸庫(kù)存血對(duì)大鼠紅細(xì)胞的影響及對(duì)離體血管調(diào)節(jié)作用的研究

盧志芬 曹俊霞

L-精氨酸(L-Arg)為一種堿性氨基酸，可參與體內(nèi)的多種代謝過(guò)程，其中L-Arg作為底物可生成NO，能抑制血小板聚集和黏附，降低血黏度，減少栓塞的發(fā)生;L-Arg還有類似硝酸脂類藥的作用，對(duì)于離體的血管具有調(diào)節(jié)其舒張功能的作用，特別是對(duì)冠狀動(dòng)脈血管的作用更為明顯。而NO對(duì)于改善休克后行輸血治療過(guò)程中血管應(yīng)激性損傷作用顯著且可靠，因此，L-Arg可能通過(guò)改善庫(kù)存血中NO濃度進(jìn)而調(diào)節(jié)患者機(jī)體血管功能。本實(shí)驗(yàn)主要研究庫(kù)存血中加入L-Arg后，對(duì)大鼠血管功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3個(gè)月左右的SD大鼠，其中雄體10只，雌體10只;體重300～400 g，大鼠飼養(yǎng)盒外部溫度18～26℃，相對(duì)濕度40% ～70%，盒內(nèi)溫度比外部環(huán)境高1～2℃，溫度高5% ～10%，噪音85分貝以下，氨濃度20 PPm以下，通風(fēng)換氣8～12次/h，添加飼料2次/周，換水2～3次/周，換窩1～2次/周，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。經(jīng)中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 儀器及試劑:ABL735血?dú)夥治鰞x及配套試劑(丹麥，Radiometer公司);BV-100懸絲流變儀及配套試劑(北京，泰諾德公司);LBY-BX紅細(xì)胞變形儀(北京，普利生儀器有限公司);550型酶標(biāo)儀(美國(guó)，Bio-Rad公司)，Arg(美國(guó)，F(xiàn)luka公司)、血漿游離血紅蛋白測(cè)定試劑盒(北京，瑞爾達(dá)生物科技有限公司)等。

1.2.2 血液標(biāo)本:血液由廊坊市中心血站提供。選擇4名廊坊市定期無(wú)償獻(xiàn)血者，2人為O型，1人為A型，1人為B型，RhD血型均為陽(yáng)性，均為漢族，年齡30～46歲。抽取靜脈血400 ml/人，分裝為200 ml/袋，其中一袋用白細(xì)胞濾器去除白細(xì)胞，分離出紅細(xì)胞，加入紅細(xì)胞保養(yǎng)液，制備成懸浮紅細(xì)胞，放置在4℃血液儲(chǔ)存冰箱中。標(biāo)本留取在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，按照各檢測(cè)項(xiàng)目要求，每7天留取1次，進(jìn)行檢測(cè)。全部血液和血液制品4℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(L-Arg組)和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組在CPD-A保養(yǎng)液中加入L-Arg，終濃度為3 000 μmol/L;對(duì)照組:用等體積的鹽水代替L-Arg。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程:用斷頭法處死大鼠，取其主動(dòng)脈血管并剪成3～5 mm長(zhǎng)的小段，利用帶掛鉤的轉(zhuǎn)換器將血管穿在小三角環(huán)上，兩三角環(huán)穿掛血管的兩條底邊應(yīng)平行，使力的方向與換能器金屬?gòu)椘３执怪辈⑶柏?fù)荷歸零。當(dāng)血管環(huán)預(yù)收縮至平臺(tái)時(shí)，加入不含精氨酸的血液，等待15 min左右，等其效用達(dá)平臺(tái)，記錄曲線，采集信號(hào);放掉血液，重新用K-H液平衡45 min，每15分鐘換1次液。待張力恢復(fù)到0時(shí)，重復(fù)第7步，用KCl重新建立收縮平臺(tái);加入含精氨酸的血液，待15分鐘后，等其效用達(dá)平臺(tái)，記錄曲線，采集信號(hào)。

1.4 紅細(xì)胞理化特性相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 電解質(zhì)、血?dú)夥治?、RBC變形性、聚集性、總 Hb-NO。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件，先用VC、CS、UN、AR1和SPPOW 5種協(xié)方差結(jié)構(gòu)模型擬合資料的情況，選擇AIC、BIC最小的模型，說(shuō)明該模型擬合資料較好;主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)采用具有1個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，其他數(shù)據(jù)采用具有兩個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，計(jì)算F值和P值，再進(jìn)行各組受試對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)之間的兩兩比較，計(jì)算出P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血液pH值、離子濃度、ME及碳酸氫鹽濃度檢測(cè) L-Arg 組與對(duì)照組分別在 0、7、14、21、28、35 d時(shí)檢測(cè)血液中pH值、離子濃度、ME和碳酸氫鹽濃度，經(jīng)方差分析和各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，以上各指標(biāo)2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組不同時(shí)間點(diǎn)血液中pH值、離子濃度、ME及碳酸氫鹽濃度比較n=10，±s

表1 2組不同時(shí)間點(diǎn)血液中pH值、離子濃度、ME及碳酸氫鹽濃度比較n=10，±s

0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d pH項(xiàng)目值對(duì)照組 6.79 ±0.09 6.58 ±0.03 6.52 ±0.04 6.49 ±0.04 6.42 ±0.02 6.43 ±0.03 L-Arg 組 6.78 ±0.07 6.59 ±0.04 6.52 ±0.05 6.49 ±0.05 6.43 ±0.03 6.43 ±0.02 K+(mmol/L)對(duì)照組 2.55 ±0.19 7.59 ±0.22 11.18 ±0.36 14.25 ±0.37 17.53 ±0.73 19.63 ±1.02 L-Arg 組 2.53 ±0.10 7.58 ±0.22 11.23 ±0.32 14.22 ±0.35 17.58 ±0.68 18.68 ±0.99 Na+(mmol/L)對(duì)照組 128.8 ±2.8 121.2 ±1.0 117.8 ±0.5 113.8 ±0.5 110.8 ±1.5 109.8 ±1.5 L-Arg 組 128.0 ±1.4 121.25 ±0.95 117.0 ±0.5 113.7 ±0.5 111.0 ±1.4 109.7 ±1.5 Cl－(mmol/L)對(duì)照組 68.0 ±4.8 63.9 ±2.1 64.0 ±1.4 64.5 ±2.1 68.8 ±1.3 65.8 ±1.3 L-Arg 組 68.0 ±4.8 63.8 ±1.0 64.2 ±1.2 65.0 ±1.8 68.8 ±0.5 66.5 ±0.6 ME離子(mmol/L)對(duì)照組 1.4 ±0.4 5.2 ±0.9 7.8 ±1.1 10.4 ±1.3 10.4 ±1.3 13.5 ±0.8 L-Arg 組 1.3 ±0.4 5.2 ±0.8 7.9 ±1.3 10.6 ±1.4 11.1 ±2.0 13.6 ±0.8碳酸氫鹽離子(mmol/L)對(duì)照組 8.33 ±1.57 4.78 ±0.59 3.78 ±0.55 3.23 ±0.50 2.60 ±0.22 2.58 ±0.24 L-Arg 組 8.10 ±1.12 4.78 ±0.62 3.83 ±0.64 3.28 ±0.55 2.55 ±0.26 2.58 ±0.24

2.2 2 組血?dú)夥治鼋Y(jié)果 分別與保存 0、7、14、21、28、35 d取血，進(jìn)行血?dú)夥治觯琇-Arg對(duì)庫(kù)存血氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)和血氧飽和度(SO2)無(wú)明顯影響(P ＞0.05)。L-Arg組 PO2、PCO2和 SO2的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組分別在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)圖2。

表2 2組不同時(shí)間血?dú)夥治霰容^n=10，xˉ±s

2.3 2組紅細(xì)胞變形性和聚集性檢測(cè) 分別與0、7、14、21、28、35 d取血，檢測(cè)紅細(xì)胞的變形性和聚集性，L-Arg對(duì)紅細(xì)胞變形性和聚集性的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。2組紅細(xì)胞變形性(圖3-A)和聚集性(圖3-B)分別在各時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 2組紅細(xì)胞變形性和聚集性比較n=10，xˉ±s

圖1 2組紅細(xì)胞變型性和聚集性比較

2.4 2組游離血紅蛋白檢測(cè) 分別于0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d取血，檢測(cè)游離血紅蛋白含量(圖4)。在0 d、7 d、14 d時(shí)，方差分析和兩兩比較結(jié)果顯示，2組游離血紅蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在21 d、28 d、35 d時(shí)，L-Arg組游離血紅蛋白含量低于對(duì)照組，方差分析和各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

2.5 2組血管舒張功能檢測(cè) L-Arg組與對(duì)照組分別在7 d、16 d、35 d時(shí)，用大鼠主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管舒張功能。方差分析結(jié)果顯示，L-Arg對(duì)血管舒張功能的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。L-Arg組血管舒張功能與對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)表5、圖3。

表4 2組不同時(shí)間點(diǎn)血液中游離血紅蛋白含量 n=10，mg/L，±s

表4 2組不同時(shí)間點(diǎn)血液中游離血紅蛋白含量 n=10，mg/L，±s

0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d對(duì)照組 25±17 79±31 201±52 284±91 486±103 596±112組別L-Arg組 26±17 76±14 157±36 200±43* 364±72* 455±66*

圖2 2組游離血紅蛋白水平比較

表5 2組不同時(shí)間點(diǎn)血管舒張能力 n=10，%，±s

表5 2組不同時(shí)間點(diǎn)血管舒張能力 n=10，%，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

7 d 16 d 35 d對(duì)照組 44±3 37±12 24±6組別L-Arg組 76±5* 64±25* 55±12*

3 討論

圖3 2組不同時(shí)間點(diǎn)血管舒張功能

3.1 L-Arg促進(jìn)庫(kù)存血NO生成L-Arg本身是NOS的底物，是產(chǎn)生NO的生成前體，在NOS作用下生成NO和胍氨酸［1］。且L-Arg作為一種治療血氨升高的氨基酸類藥物在臨床應(yīng)用已經(jīng)比較普遍，不良反應(yīng)較少。L-Arg做為底物，生成NO后發(fā)揮生理功能的相關(guān)研究多集中在心血管等領(lǐng)域，在輸血領(lǐng)域研究還未見(jiàn)報(bào)道。有研究表明，一定劑量的L-Arg能抑制血小板聚集和黏附，降低血黏度，減少栓塞的發(fā)生;應(yīng)用多普勒超聲波檢查頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜去除患者腦部的栓塞信號(hào)，發(fā)現(xiàn)靜脈注射L-Arg的患者信號(hào)強(qiáng)度明顯減小，提示LArg對(duì)栓塞性疾病具有一定療效［2］;L-Arg還有類似硝酸脂類藥的作用，對(duì)于離體的血管具有舒張作用，特別是對(duì)冠狀動(dòng)脈血管的作用更為明顯。為了改善庫(kù)存血舒張血管的功能，避免外源性加入帶來(lái)的潛在不利影響，本研究利用紅細(xì)胞上含有功能性eNOS的特點(diǎn)，在血液中加入不同劑量的L-Arg，使其產(chǎn)生內(nèi)源性的NO，對(duì)血管進(jìn)行調(diào)節(jié)作用。

3.2 NO對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)作用NO是存在于各種細(xì)胞內(nèi)的一種重要的信號(hào)分子，可以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的功能。SNO是NO的運(yùn)輸形式，從而增加組織灌流，這對(duì)紅細(xì)胞運(yùn)輸氧的功能是十分重要的［3］。紅細(xì)胞中的血紅蛋白已經(jīng)被公認(rèn)為是NO的貯存庫(kù)，傳遞O2和釋放出NO給低pH值或低氧張力區(qū)域，引起血管擴(kuò)張。

國(guó)外研究報(bào)道在庫(kù)存血中造成紅細(xì)胞變形性下降的原因與NO含量的下降有關(guān)，NO可以影響RBC膜的性質(zhì)，質(zhì)膜將變得僵硬，紅細(xì)胞脆性增加和變形能力降低而不能輕松通過(guò)微血管，從而不利于紅細(xì)胞對(duì)組織供氧［4－6］。研究顯示血漿中的NO含量在貯存時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有發(fā)生明顯變化，但當(dāng)紅細(xì)胞Hb中的SNO酶將NO轉(zhuǎn)換為生物活性的SNO-Hb［7］，才具有血管舒張的活性。當(dāng)輸注庫(kù)存紅細(xì)胞時(shí)，由于SNO-Hb已經(jīng)耗竭，血液擴(kuò)張血管功能失調(diào)，加之紅細(xì)胞變形能力減弱，則血液會(huì)堆積在較大的血管，進(jìn)一步引起堵塞和缺血，在缺血患者中引起不良后果。

3.3 L-Arg可以通過(guò)促進(jìn)庫(kù)存血NO生成調(diào)節(jié)血管舒張功能。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)加入L-Arg的庫(kù)存血質(zhì)量進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，在保存期內(nèi)，血液的pH值、離子濃度、ME、碳酸氫鹽、血?dú)夂俊⒓t細(xì)胞的變形性和聚集性均沒(méi)有發(fā)生明顯變化;在血液游離血紅蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，血液保存2周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組游離血紅蛋白含量均有所升高，但是實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組，推測(cè)L-Arg對(duì)紅細(xì)胞膜具有一定的穩(wěn)定作用。本實(shí)驗(yàn)并主要研究了L-Arg對(duì)血管功能的影響，結(jié)果顯示，對(duì)照組在血液保存期內(nèi)，血管舒展功能較弱，1周后均在47%以下，加入L-Arg后，血管舒展功能明顯升高，均在55%以上，提示L-Arg對(duì)改善庫(kù)存血的舒張血管功能有明顯作用。

L-Arg是人體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，是多種蛋白質(zhì)的組成成分，如果攝入合理的劑量，不良反應(yīng)會(huì)比較小，甚至沒(méi)有不良反應(yīng)發(fā)生。在血液中加入L-Arg后，總Hb-NO含量增加，在體外實(shí)驗(yàn)中，舒血管功能明顯增強(qiáng)，對(duì)于急性輸血患者，可降低其血管內(nèi)壁損傷可能，從而減少炎性介質(zhì)等產(chǎn)生幾率。另一方面，以LArg作為底物生成NO后對(duì)血管功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以避免因直接加入NO導(dǎo)致庫(kù)存血重新亞硝基化，難以做到標(biāo)準(zhǔn)化，以及過(guò)量的NO導(dǎo)致抑制組織細(xì)胞的氧化呼吸，引起多器官功能衰竭的弊端，但對(duì)于低血壓患者急救用血是否會(huì)有不利影響，尚有待進(jìn)一步研究。盡管L-Arg不是目前獲批的紅細(xì)胞保存液的成分，若在保存液中添加新的成分需要進(jìn)一步深入的研究，但利用紅細(xì)胞自身的eNOS，通過(guò)加入L-Arg來(lái)生增加庫(kù)存血中的NO含量，是改善血液舒張血管功能的比較理想的方法，是提高輸血安全性和有效性的一個(gè)可能的發(fā)展方向，值得今后進(jìn)一步深入研究探討。

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