鱉源致病性嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

林鋒　劉莉　曹錚　等

摘要：從患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）肺組織中分離到優(yōu)勢(shì)菌1株，進(jìn)行了表型特征分析和16S rDNA序列測(cè)定。結(jié)果表明，該菌為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），通過對(duì)健康中華鱉進(jìn)行人工感染，發(fā)現(xiàn)該菌具有致病性；選取20種常規(guī)藥敏試紙進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該嗜水氣單胞菌對(duì)慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感，對(duì)諾氟沙星、紅霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中敏，對(duì)其他11種抗生素具有耐藥性。

關(guān)鍵詞：鱉（Pelodiscus sinensis）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；16S rDNA；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5487-03

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種條件性致病菌，廣泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人類均有致病性[1]。嗜水氣單胞菌作為淡水養(yǎng)殖動(dòng)物重要的病原菌之一，目前已確定淡水魚類細(xì)菌性敗血癥、鱉“紅底板”病等多種病害是由其所導(dǎo)致的[2，3]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，抗生素的普遍使用導(dǎo)致了嗜水氣單胞菌的耐藥性也日趨嚴(yán)重[4]。因此，本研究通過對(duì)患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）體內(nèi)的病原菌分離、16S rDNA序列分析來(lái)鑒定病原菌的類別，并利用藥敏試驗(yàn)來(lái)初步篩選治療該病癥的藥物，開展典型性中華鱉病癥的研究，有利于針對(duì)不同的病癥采取有效的治療措施，降低經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2013年4月，取自浙江省湖州市南潯區(qū)某中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)外塘，病鱉體重為820 g左右。臨床癥狀為頸部腫大，腹部有氣脹感；部分嚴(yán)重者口鼻出血。病理剖檢發(fā)現(xiàn)肺腫大，部分呈粉紅色；肝脾略有腫大，有的呈花斑狀；咽喉上皮處有顆粒狀的突起。從開始發(fā)現(xiàn)到陸續(xù)性死亡時(shí)間為7～15 d，累積死亡率近70%。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯干粉、瓊脂干粉、細(xì)菌理化特性鑒定用的培養(yǎng)基和藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物公司； 革蘭氏染液購(gòu)自南京建成生物工程研究所；PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 在無(wú)菌條件下，用酒精棉球擦拭患病鱉體表后進(jìn)行解剖，取血、心、肝、脾和腸等組織樣品，分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板（pH 7.4）上劃線培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，根據(jù)菌落特征，挑取單菌落劃線分離。

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察 將分離菌接種于培養(yǎng)基平板上，置于 28 ℃培養(yǎng)12 h，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.3 致病性試驗(yàn) 將分離菌接種于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，取菌體涂片鏡檢，確認(rèn)純度后低速離心收集沉淀，加入滅菌生理鹽水制成細(xì)菌懸液。取6只中華鱉分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組 3只。試驗(yàn)組每只鱉肌肉注射0.5 mL 細(xì)菌懸液（濃度約為1×109 CFU/mL）；對(duì)照組每只注射0.5 mL生理鹽水，分別隔離飼養(yǎng)，記錄發(fā)病和死亡情況。

1.2.4 16S rDNA序列測(cè)定 16S rDNA基因序列的擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R： 5′-TACGGTTACCTT GTTACGACTT-3′。擴(kuò)增片段大小約1 470 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶 0.5 μL，模板菌液3 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 藥物敏感性試驗(yàn)按紙片擴(kuò)散法[5]進(jìn)行，測(cè)定抑菌圈直徑，并參照NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行敏感性判定。檢測(cè)的抗生素包括青霉素G、頭孢他啶、頭孢西丁、復(fù)達(dá)欣、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、阿米卡星、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、呋喃唑酮、諾氟沙星和環(huán)丙沙星等20種。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的形態(tài)特征

從患病的中華鱉肺組織中分離到一種優(yōu)勢(shì)菌，標(biāo)記為J。細(xì)菌J染色后呈紅色，短桿狀，兩端鈍圓，直形或弧形，單個(gè)或成對(duì)排列，初步判定為革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。

2.2 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

健康中華鱉接種細(xì)菌J的懸液。接種后12 d對(duì)照組正常，而感染組則出現(xiàn)死亡。對(duì)死亡鱉進(jìn)行分菌培養(yǎng)，經(jīng)染色、鏡檢為相同菌株。結(jié)果表明，分離菌J具有致病性，且感染中華鱉后出現(xiàn)典型性特征即肺腫大（圖2）。

2.3 細(xì)菌16S rDNA序列鑒定

利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3），獲得了菌株的核苷酸序列。將核苷酸測(cè)序結(jié)果通過BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株J與GenBank上收錄的嗜水氣單胞菌同源性高達(dá)99%，根據(jù)細(xì)菌J的表型特征和生理生化特性，可以判定細(xì)菌J與嗜水氣單胞菌為同一屬的細(xì)菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)

選取常用的20種抗生素藥敏紙片，對(duì)嗜水氣單胞菌J進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果（表1）表明，嗜水氣單胞菌J對(duì)慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感，對(duì)諾氟沙星、紅霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中敏，對(duì)其他11種抗生素有耐藥性。

3 小結(jié)與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)革蘭氏染色進(jìn)行表型分析，結(jié)合目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增法[7，8]，較快速、準(zhǔn)確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細(xì)菌回感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發(fā)紅。而藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，這種菌有較強(qiáng)的耐藥性。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產(chǎn)生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細(xì)胞外毒素[9-11]，從而引發(fā)中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對(duì)不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對(duì)性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發(fā)病快、持續(xù)性死亡的特征，且死亡率達(dá)到70%左右，屬于高致病菌株，對(duì)其研究有利于為診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 屠 晶）

3 小結(jié)與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)革蘭氏染色進(jìn)行表型分析，結(jié)合目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增法[7，8]，較快速、準(zhǔn)確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細(xì)菌回感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發(fā)紅。而藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，這種菌有較強(qiáng)的耐藥性。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產(chǎn)生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細(xì)胞外毒素[9-11]，從而引發(fā)中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對(duì)不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對(duì)性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發(fā)病快、持續(xù)性死亡的特征，且死亡率達(dá)到70%左右，屬于高致病菌株，對(duì)其研究有利于為診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）

3 小結(jié)與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)革蘭氏染色進(jìn)行表型分析，結(jié)合目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增法[7，8]，較快速、準(zhǔn)確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細(xì)菌回感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發(fā)紅。而藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，這種菌有較強(qiáng)的耐藥性。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產(chǎn)生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細(xì)胞外毒素[9-11]，從而引發(fā)中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對(duì)不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對(duì)性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發(fā)病快、持續(xù)性死亡的特征，且死亡率達(dá)到70%左右，屬于高致病菌株，對(duì)其研究有利于為診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

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[10] SANTOS J A， GONZALEZ C J， OTERO A， et al. Hemolytic activity and siderophore production in different Aeromonas species isolated from fish[J]. Appl Environ Microb， 1999， 65（12）：5612-5614.

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（責(zé)任編輯 屠 晶）