豬圓環(huán)病毒2型SYBR GreenⅠ熒光定量PCR診斷方法的建立

余波　周思旋　譚詩文　等

摘要：根據(jù)GenBank中豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬圓環(huán)病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法。擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線分析只出現(xiàn)1個(gè)單特異峰，無引物二聚體，對PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均無陽性信號，可重復(fù)性好，測靈敏度可達(dá)4.0×101拷貝/μL。結(jié)果表明，建立的豬圓環(huán)病毒2型SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異、靈敏、快速、重復(fù)性好，適合于豬圓環(huán)病毒2型臨床樣品的檢測。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；ORF2基因；SYBR Green I熒光定量PCR

中圖分類號：S854.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5474-04

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2， PCV-2）主要導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的發(fā)生，表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)損傷，淋巴細(xì)胞減少、淋巴結(jié)腫大等病變，同時(shí)引起其他病原的繼發(fā)感染，目前已成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一[1-3]。目前檢測PCV-2主要有ELISA、膠體金、PCR等方法，但ELISA、膠體金主要用于檢測PCV-2抗體，且操作復(fù)雜、耗時(shí)長[4，5]。普通PCR不能進(jìn)行定量分析，且靈敏度相對較低，無法檢測豬場的隱性感染。熒光定量PCR是與常規(guī)PCR比較，具有重復(fù)性好、靈敏度高、能夠定量等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種疾病病原的檢測[6，7]。本研究根據(jù)GenBank中豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立豬圓環(huán)病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，為豬圓環(huán)病毒2型臨床樣品的檢測提供科學(xué)的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：PCV-2、PRV閩-1株、PPV強(qiáng)毒株7909、CSFV、PRRSV、豬源大腸桿菌由貴州省畜禽疫病研究實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑及儀器：Goldview、Tris、EDTA、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相應(yīng)10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I熒光定量PCR酶等購自寶生物（大連）工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR儀為Eppendorf Mastercycler ep realplex 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)ORF2 GenBank中豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因序列設(shè)計(jì)1對特異性引物，上游引物：5′-GGAAGACCAATGTACACGTCATT-3′，下游引物：5′-GGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTC-3′，引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1）組織樣品：取待檢樣品淋巴結(jié)組織樣品共約0.5 g，加入500 μL PBS緩沖液，待檢樣品研磨后-70 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。豬大腸桿菌參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA-20 ℃保存。

2）血清樣品：取50 μL血清加入等體積的血清裂解緩沖液（50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5%SDS），混勻后煮沸5 min，12 000 r/min離心取上清液2 μL用于熒光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PCV2-ORF2陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用“1.2.1”中的引物，對PCV-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增的目的片段與pMD-18-克隆載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，重組體命名為pMD-18T-PCV2-ORF2，同時(shí)送寶生物工程（大連）有限公司測序。用紫外分光光度計(jì)測定測序正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-PCV2-ORF2在D260 nm/D280 nm處的吸光度，得到重組質(zhì)粒的濃度和純度，進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，對熒光定量PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度（50、55、60 ℃）、引物濃度（5、10、20 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化以確定最佳反應(yīng)條件。上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板1 μL，用超純水補(bǔ)足至25 μL，同時(shí)以去離子水作為空白對照。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s、退火溫度（50、55、60 ℃）10 s、72 ℃10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用紫外分光光度計(jì)測定測序正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-PCV2-ORF2，計(jì)算出重組質(zhì)粒的濃度和純度，計(jì)算DNA拷貝數(shù)，隨后將標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本進(jìn)行連續(xù)10倍系列稀釋，以“1.2.4”的條件進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)稀釋倍數(shù)3個(gè)重復(fù)，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒pMD-18T-PCV2-ORF2計(jì)算DNA拷貝數(shù)后，進(jìn)行10倍比稀釋后分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)稀釋倍數(shù)3個(gè)重復(fù)，以確定建立的熒光定量PCR診斷的敏感性。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法重復(fù)檢測PCV-2 DNA樣品3次，以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2.9 熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測 對2012～2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區(qū)幾個(gè)生豬養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖專業(yè)戶采集的75份疑似病料（組織），194頭份發(fā)病豬場未發(fā)病豬血清，應(yīng)用建立的熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行檢測，同時(shí)應(yīng)用文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行普通PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD-18T-PCV2-ORF2陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用“1.2.1”中的引物，對PCV-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能有效擴(kuò)增出目的片段，片段大小為105 bp，無非特異性片段產(chǎn)生（圖1）。將寶生物（大連）工程有限公司測序結(jié)果與GenBank中的PCV-2 ORF2基因序列比對，核苷酸相似度為98.9%～100%。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

熒光定量PCR反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為：退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，能出現(xiàn)最高的熒光值、最小的Ct值，且在溶解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰。

2.3 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)樣品10倍倍比稀釋，取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101拷貝/μL 7種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），線性回歸方程為Ct=-2.894×lgcopies+32.89（R2=0.994）。

2.4 溶解曲線分析

在SYBR Green I熒光定量PCR結(jié)束后對擴(kuò)增反應(yīng)溶解曲線分析，結(jié)果見圖3。由圖3可見，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度Tm為84.0～84.4 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等其他峰值出現(xiàn)。

2.5 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)樣品倍比稀釋，取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101、4.0×100拷貝/μL 8種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。由圖4可見，結(jié)果顯示其靈敏度為4.0×101拷貝/μL。

2.6 特異性試驗(yàn)

由圖5可見，以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。結(jié)果PCV-2為陽性，而PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA為陰性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法重復(fù)檢測PCV-2 DNA樣品3次，以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，結(jié)果均一致。

2.8 熒光定量PCR對臨床樣品的檢測

對2012～2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區(qū)幾個(gè)生豬養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖專業(yè)戶75份疑似病料（組織）熒光定量PCR陽性率為29.3%（22/75），普通PCR陽性率為29.3%（22/75）。194頭份發(fā)病豬場未發(fā)病豬血清熒光定量PCR陽性率為9.2%（18/194），普通PCR陽性率為0%（0/194）。

3 小結(jié)與討論

目前利用PCR技術(shù)或者是血清學(xué)方法對豬場中的PCV-2感染情況進(jìn)行檢測是控制PMWS的有效方法[9]。普通PCR在PCV-2的凈化中發(fā)揮了重要作用，但普通PCR檢測的靈敏度相對較低，主要用于組織病料的檢測，不能有效檢出豬群血清中PCV-2的隱形感染。陳蓉等[10]建立基于TaqMan探針的豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測方法，該方法的敏感性為6×101拷貝/μL，比普通PCR高2個(gè)數(shù)量級，對臨床樣本的陽性檢出率（64%）明顯高于普通PCR（44%）。曾思遙等[11]以豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白ORF2基因，設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針，建立了PCV-2的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，可達(dá)100拷貝/μL，可有效檢測出淋巴結(jié)、肺臟等組織中的PCV-2，但其未對感染豬場未發(fā)病豬血清進(jìn)行檢測。

基于SYBR GreenⅠ的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)則無需探針，且價(jià)格較TaqMan探針低廉，雖然引物二聚體及非特異性擴(kuò)增可能影響檢測結(jié)果的特異性，但可以通過融解曲線分析克服這一缺陷[12]。本研究根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬圓環(huán)病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，靈敏度可達(dá)4.0×101拷貝/μL，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度Tm為84.0～84.4℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等其他峰值出現(xiàn)，適合于PCV-2臨床樣品的檢測。

本研究中75份疑似病死豬病料（組織）中病毒含量量較高，因此熒光定量PCR和普通PCR符合率為100%，而發(fā)病豬場未發(fā)病豬血清PRV病毒含量較低，普通PCR未檢測到血清中的病毒，而建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR能檢測到PCV-2 DNA。且本研究建立的血清中病毒提取方法，能夠快速的提取病毒DNA。因此，本研究建立的PCV-2 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR可應(yīng)用于PCV-2早期感染和隱性感染檢測，有利于豬場PCV-2的凈化。

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（責(zé)任編輯 程碧軍）

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（責(zé)任編輯 程碧軍）

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（責(zé)任編輯 程碧軍）