誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞治療缺血性卒中：誘惑與現(xiàn)實(shí)

劉宇恒，許治強(qiáng)，梁燕玲，李斯穎，林永強(qiáng)

缺血性卒中占全部卒中患者的60%～80%[1]。它嚴(yán)重影響并危害著人類的生命健康及生活質(zhì)量，發(fā)病率和病死率每年都在增長(zhǎng)[2]。目前，在臨床上關(guān)于缺血性卒中的治療方法較多，如抗凝、抗血小板聚集、改善微循環(huán)、改善腦代謝等，但這些方法對(duì)缺血區(qū)壞死的神經(jīng)細(xì)胞不能產(chǎn)生再生與修復(fù)作用。血管內(nèi)介入治療則需要專業(yè)的操作，并承擔(dān)一系列相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。而目前唯一能有效縮小病灶、改善功能損傷的藥物是重組組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA），但其有效治療時(shí)間窗為3～4.5 h[3]。中國(guó)國(guó)家卒中調(diào)查顯示，靜脈rt-PA溶栓治療率為1.9%[4]。因此，尋找新的行之有效的方法來對(duì)缺血性卒中的急性期的治療顯得尤為迫切。

近年來，干細(xì)胞移植在促進(jìn)血管形成、神經(jīng)再生、分泌營(yíng)養(yǎng)因子等方面，具有其他方法無法比擬的優(yōu)勢(shì)[5]。誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是干細(xì)胞中的一種特殊類型，它除了秉承干細(xì)胞治療優(yōu)點(diǎn)外，還克服了免疫原性、醫(yī)學(xué)倫理方面的困難，在疾病建模、藥物篩選等方面有一定潛力[6]。本文將對(duì)iPSC治療缺血性卒中的研究現(xiàn)狀、發(fā)展制約及未來展望展開綜述。

2006年，Takahashi等[7]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過相應(yīng)載體將Sox2、Oct3/4、Klf4和cMyc 4個(gè)因子整合到小鼠的成纖維細(xì)胞，獲得了一類和干細(xì)胞特性類似的克隆細(xì)胞，命名為iPSC。2007年，又利用4種相同的轉(zhuǎn)錄因子將人的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC[8]。

在缺血性卒中發(fā)生后，核心區(qū)和半暗帶神經(jīng)元相繼發(fā)生壞死、凋亡。理論上，以合適的方式植入某種能分化為各種類型細(xì)胞的干細(xì)胞將是最根本的治療措施。

目前已有大量的動(dòng)物及臨床研究證明干細(xì)胞移植可促進(jìn)缺血部位腦組織和功能的恢復(fù)，保護(hù)神經(jīng)并減少細(xì)胞凋亡[9-11]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)新的神經(jīng)元形成、保護(hù)和促進(jìn)缺血性卒中大鼠的神經(jīng)功能改善起著重要作用[12]。除了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外，神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞可分泌相關(guān)因子并保護(hù)缺血區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞，阻止疾病的進(jìn)展[13]。這些干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷的機(jī)制可能包括細(xì)胞替代、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、分泌相關(guān)因子、促發(fā)內(nèi)源性血管再生、神經(jīng)保護(hù)等[14]。但是iPSC治療缺血性卒中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果并不明朗。

將小鼠成纖維細(xì)胞來源的iPSC直接注射至大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）1 h的大鼠腦皮質(zhì)損傷區(qū)后，iPSC能夠很明顯縮減梗死灶、改善抓握及旋轉(zhuǎn)等運(yùn)動(dòng)功能，保護(hù)神經(jīng)，及減少促炎性細(xì)胞因子釋放[15]。Oki等[16]將人成纖維細(xì)胞來源的iPSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)上皮干細(xì)胞移植到大鼠MCAO 48 h后的皮層區(qū)，這些神經(jīng)干細(xì)胞能存活4個(gè)月以上，并能提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和促進(jìn)大鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。向小鼠MCAO的缺血區(qū)移植非特異性人iPSC來源的神經(jīng)元前體細(xì)胞，能夠促進(jìn)相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞增長(zhǎng)，顯著改善神經(jīng)缺損癥狀[17-20]。Wang等[21]分別將小鼠來源的iPSC和ESC移植到大鼠MCAO 90 min時(shí)的腦室中，7 d后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的神經(jīng)功能評(píng)分有顯著改善，而iPSC組和ESC組比較差異無顯著性。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)移植的干細(xì)胞能誘導(dǎo)成熟神經(jīng)細(xì)胞及血管生成，且兩組之間差異無顯著性?；蛟S在不久的將來，iPSC將能很好地替代ESC。

然而在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，卻沒得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Kawai等[22]將小鼠來源的iPSC移植到小鼠MCAO 24 h后的同側(cè)紋狀體和皮層，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的行為學(xué)差異無顯著性。Jensen等[23]先將人源iPSC體外分化成的神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSCs），并在大鼠MCAO 7 d后植入皮層區(qū)。結(jié)果iPSC雖然有分化為神經(jīng)元，但梗死灶體積并未縮小和神經(jīng)功能的改善未達(dá)到預(yù)期效果。出現(xiàn)上述陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因可能與iPSC過晚植入大鼠MCAO缺血區(qū)或者其他未知原因有關(guān)。盡管這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未達(dá)到預(yù)期效果甚至為陰性結(jié)果，但是任有研究提示iPSC移植在缺血性卒中治療中有積極作用，因此我們可以從不同的思路，從不同的角度展開iPSC的研究，以期出現(xiàn)穩(wěn)定、可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如人和不同動(dòng)物細(xì)胞來源的iPSC、不同誘導(dǎo)因子、病毒載體、iPSC生長(zhǎng)環(huán)境、iPSC誘導(dǎo)形成的特定細(xì)胞、移植的部位、移植的時(shí)間，這些都是需要我們慎重考慮的問題，都將促使我們開展更多更完善的動(dòng)物及進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。

雖然iPSC在治療缺血性卒中方面蘊(yùn)藏著巨大潛力，但是在基礎(chǔ)研究及以后臨床的實(shí)際運(yùn)用中，仍然存在著一些困境，現(xiàn)對(duì)一些iPSC的自身不足和改進(jìn)的方法做一介紹。

iPSC作為干細(xì)胞的一種特殊類型，存在誘導(dǎo)率低、致瘤性、單性遺傳、免疫原性等難題，針對(duì)這些問題，不斷有學(xué)者對(duì)其提供不同的解決方案。如Anokye-Danso用小鼠的微小RNA（micro RibonucleicAcid，miRNAs）誘導(dǎo)皮膚纖維細(xì)胞成功制備了iPSC，并將誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率提高100倍以上[24]。也有研究提示應(yīng)激引起的p38活化能增強(qiáng)iPSC的誘導(dǎo)率，在高滲條件下，能將Sox2、Oct3/4、Klf4和cMyc這4個(gè)因子的誘導(dǎo)效率提高10倍[25]。

在重編程制備iPSC的轉(zhuǎn)錄因子中，c-Myc和Klf4都屬于癌基因，因此在轉(zhuǎn)錄過程中，這些癌基因有可能會(huì)被整合到受體基因組，引起基因突變，形成具有致癌性的iPSC[26]。L-Myc基因同樣具有轉(zhuǎn)錄的作用，替代c-Myc后，可以最大程度減少iPSC成瘤性[27]。近年來iPSC另一重大技術(shù)突破是蛋白質(zhì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)[28]。傳統(tǒng)的基因誘導(dǎo)使用的是外源性遺傳物質(zhì)，它會(huì)對(duì)靶細(xì)胞的基因組產(chǎn)生影響，有致癌性。而蛋白質(zhì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)則是直接向細(xì)胞導(dǎo)入蛋白質(zhì)，不依賴轉(zhuǎn)錄因子，不會(huì)影響靶細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，致瘤性這一問題可以得到有效解決，從而大幅度提高了安全性。但其研究費(fèi)用高昂，技術(shù)比較復(fù)雜，目前尚處于研究階段。

iPSC在具體功能上與ESC類似，具有分化的全能性，同時(shí)在技術(shù)層面避免了ESC所面對(duì)的一些倫理學(xué)問題和法律沖突。但是自身的iPSC完全有可能會(huì)分化為具有生殖能力的配子，因此迫使人類在運(yùn)用iPSC時(shí)不得不面對(duì)單性遺傳的倫理問題。

在iPSC的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，仍可檢測(cè)到免疫反應(yīng)的存在[29]。并非所有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其衍生物都能激發(fā)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的免疫原性與胚胎干細(xì)胞仍有所區(qū)別，其差異性體現(xiàn)在細(xì)胞來源的不同及主要組織相容復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的不同[30]。iPSC在移植時(shí)仍需要關(guān)注免疫反應(yīng)的存在。

iPSC從2006年問世至今，其技術(shù)不斷成熟和完善。更多的研究給不同疾病治療帶來了新的曙光，同時(shí)iPSC技術(shù)在缺血性卒中治療方面也顯得日益成熟，有望在以后的臨床中的得到實(shí)際應(yīng)用。結(jié)合目前實(shí)際情況，從iPSC的安全性、可行性、高效性、便捷性等方面展開研究，可能給患者帶來更多的治療希望。

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【點(diǎn)睛】

本文重點(diǎn)介紹了iPSC治療缺血性卒中的進(jìn)展和不足，對(duì)基礎(chǔ)和臨床研究有一定的指導(dǎo)意義。