長(zhǎng)期施加氮肥及氧化鈣調(diào)節(jié)對(duì)酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響

張苗苗，王伯仁，李冬初，賀紀(jì)正，張麗梅,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部祁陽(yáng)紅壤生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站, 永州 426100

長(zhǎng)期施加氮肥及氧化鈣調(diào)節(jié)對(duì)酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響

張苗苗1,2，王伯仁3，李冬初3，賀紀(jì)正1，張麗梅1,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部祁陽(yáng)紅壤生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站, 永州 426100

酸性土壤; 氧化鈣調(diào)節(jié); 硝化作用; 氨氧化古菌(AOA); 氨氧化細(xì)菌(AOB)

酸性土壤(pH <5.5)在我國(guó)分布面積廣泛，是我國(guó)熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物如茶樹、林木、果樹和糧食作物的重要產(chǎn)地。近幾十年來(lái)，因化學(xué)氮肥的過(guò)量施用和酸沉降加劇，我國(guó)農(nóng)田土壤的酸度逐步升高，面積也不斷增加[1]。為了緩解土壤酸化，農(nóng)業(yè)中常采用田間施加化學(xué)改良劑(如石灰(CaO))的方法來(lái)進(jìn)行改良，效果顯著[2-3]。

硝化作用是土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過(guò)程，除影響土壤中無(wú)機(jī)氮對(duì)植物的有效性外，硝化作用對(duì)酸性土壤進(jìn)一步酸化、有毒金屬元素的溶解釋放等都有重要影響[1, 4-6]。氨氧化作用作為硝化作用的限速步驟，是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)，主要由氨氧化細(xì)菌(AOB)[7]和古菌(AOA)[8-10]驅(qū)動(dòng)。大量分子生態(tài)學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雖然多種環(huán)境因子，包括溫度、pH值、施肥、土壤類型及土地利用方式等都會(huì)影響兩類氨氧化微生物的群落組成和數(shù)量，但pH值是影響其分布及功能活性的決定性因子。已有研究發(fā)現(xiàn)，隨著pH值增加，AOA和AOB群落組成發(fā)生明顯演替，AOA的數(shù)量和amoA基因的表達(dá)活性顯著降低，AOB則呈相反趨勢(shì)[11-15]。2007年，對(duì)湖南祁陽(yáng)紅壤長(zhǎng)期定位實(shí)驗(yàn)站連續(xù)16a施加不同化學(xué)肥料處理土壤中的氨氧化細(xì)菌和古菌的群落組成進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施加無(wú)機(jī)氮肥顯著降低了AOA和AOB的數(shù)量，并改變了AOA的群落組成，但對(duì)AOB的群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，揭示了AOA可能在該酸性土壤硝化作用中起重要作用[16]。通過(guò)穩(wěn)定性同位素探測(cè)技術(shù)(stable isotope probing, SIP)等的研究，也證實(shí)氨氧化古菌是一些酸性土壤硝化作用的主導(dǎo)者[17]。

以上研究揭示了氨氧化古菌對(duì)酸性土壤硝化作用的重要貢獻(xiàn)，然而在多數(shù)酸性土壤中也能檢測(cè)到數(shù)量相當(dāng)?shù)陌毖趸?xì)菌，但對(duì)這些酸性土壤中氨氧化細(xì)菌的存在有何生態(tài)學(xué)意義并不清楚。由于多年連續(xù)施肥，湖南祁陽(yáng)紅壤定位施肥實(shí)驗(yàn)站長(zhǎng)期接受施化學(xué)氮肥處理的土壤pH值持續(xù)下降，土壤肥力和生產(chǎn)力嚴(yán)重受阻，該實(shí)驗(yàn)站于2010年將原施氮肥(N)、氮鉀肥(NK)、氮磷肥(NP)、氮磷鉀肥(NPK)處理的小區(qū)劃分出一半進(jìn)行添加氧化鈣處理，以期通過(guò)添加氧化鈣調(diào)節(jié)土壤pH值，改善土壤質(zhì)量。本研究在2007年對(duì)該樣地土壤研究的基礎(chǔ)上，對(duì)持續(xù)施肥5a后以及添加CaO處理對(duì)土壤硝化作用和氨氧化細(xì)菌和古菌的影響進(jìn)行了跟蹤研究，以期為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)酸性土壤硝化作用過(guò)程及其機(jī)制提供參考，為農(nóng)田施肥及酸性土壤改良管理方式提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究中的土壤樣品采集于湖南省祁陽(yáng)紅壤定位施肥實(shí)驗(yàn)站(26°45′N，111°52′E)，該地屬于典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫18 ℃，年降水量1300 mm。本實(shí)驗(yàn)共選擇了9個(gè)處理，包括1990年開始的長(zhǎng)期施肥處理及2010年開始的施加氧化鈣(CaO)處理，具體情況如下：1)不施肥(Control)，2)氮肥(N)，3)氮鉀肥(NK)，4)氮磷肥(NP)，5)氮磷鉀肥(NPK)，6)氮肥加氧化鈣(N+CaO)，7)氮鉀肥加氧化鈣(NK+CaO)，8)氮磷肥加氧化鈣(NP+CaO)，9)氮磷鉀肥加氧化鈣(NPK+CaO)。肥料用量為年施用N 300 kg/hm2、P2O5120 kg/hm2、K2O 120 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O比值為1∶0.4∶0.4；氧化鈣年施用量為2550 kg/hm2。

樣品采集于2012年7月，所采樣品均為0—20 cm表層土壤。每個(gè)處理小區(qū)取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)分別取5個(gè)點(diǎn)混合而成。樣品于低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室后，剔除石礫和植物殘根等雜物，過(guò)2 mm篩處理，一部分保存于4 ℃冰箱用于土壤基本化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，其余樣品放置于-80 ℃保存，用于分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)分析。

1.2 土壤化學(xué)指標(biāo)及硝化潛勢(shì)測(cè)定

1.3 土壤DNA提取

土壤DNA提取以MoBio PowerSoilTMDNA(MO BIO laboratories, CA, US))試劑盒進(jìn)行提取，稱取0.25 g土壤按照試劑盒操作指南進(jìn)行，并略加修改：細(xì)胞破碎在FastPrep上進(jìn)行，破碎速度為5.0，時(shí)間為45 s。DNA提取后于-20 ℃保存待用，所有DNA均稀釋10倍用于下游實(shí)驗(yàn)。

1.4 定量PCR分析

氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)定量PCR分析均采用SYBR Green法，反應(yīng)在iCycle iQ5(Bio-Rad, USA)儀器上進(jìn)行。 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含12.5 μL 2 × SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Japan)，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足至25 μL[19]。定量PCR所用的擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

1.5 變性梯度凝膠電泳分析

氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)分析采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)法，DGGE在DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, USA)中進(jìn)行。AOAamoA基因PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中包括12.5 μL 2 × Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Japan),10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。AOBamoA基因擴(kuò)增體系除10 μmol/L正反向引物用量為0.4 μL外，其余與AOAamoA反應(yīng)體系相同。DGGE-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件如表1所示。DGGE電泳在6%聚丙烯酰胺膠中進(jìn)行，AOAamoA基因所用的變性膠濃度范圍為10%—45%，電泳條件為90 V，12 h。AOBamoA基因變性膠濃度范圍為30%—55%，電泳條件為120 V，8 h。每個(gè)處理選取兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行DGGE分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所有相關(guān)分析均采用Pearson相關(guān)分析；添加N與N+CaO、NK與NK+CaO、NP與NP+CaO、NPK與NPK+CaO各組處理間的差異性分析采用成對(duì)數(shù)據(jù)T檢驗(yàn)分析；多組數(shù)據(jù)間的方差分析采用單因素方差分析ANOVA。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均用SPSS 19實(shí)現(xiàn)，P<0.05即認(rèn)為差異顯著。DGGE圖譜的聚類分析以Quantity One軟件讀取條帶后以UPGMA方法進(jìn)行。

表1 定量PCR及DGGE-PCR中所用引物及反應(yīng)程序

2 結(jié)果

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)及硝化潛勢(shì)(PNR)

表2 土樣的基本化學(xué)性質(zhì)及硝化潛勢(shì)(±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

2.2 氨氧化微生物的豐度變化

圖1 不同氮肥處理及氧化鈣(CaO)調(diào)節(jié)處理土壤中氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因豐度Fig.1 Abundance of archaeal and bacterial amoA gene in soils under different N fertilizers and CaO treatments±標(biāo)準(zhǔn)誤差；不同大寫字母表示AOA豐度在各處理之間的差異顯著性，不同小寫字母表示AOB豐度在各處理之間的差異顯著性

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)各處理土壤中的氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的amoA基因豐度進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示。成對(duì)數(shù)據(jù)T檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，在所有未加CaO的處理中，AOAamoA基因的豐度均顯著高于AOB(P<0.05)，二者的比值為10.9—44.3。添加CaO后，AOA豐度在一定程度上降低，AOB豐度顯著增加(P<0.05)，使得AOA和AOB二者基因豐度相當(dāng)，無(wú)顯著差異，其比值降低至0.83—1.94。在所有處理中，對(duì)照土壤AOA豐度最高(1.39×109copies/g)，N+CaO土壤AOA豐度最低(5.31×107copies/g)；NPK+CaO處理土壤中AOB豐度最高(2.42×108copies/g)，N肥處理土壤中AOB豐度最低(3.34×106copies/g)。另外，土壤硝化潛勢(shì)與土壤中AOA和AOBamoA基因豐度均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，但與AOA和AOBamoA基因豐度之和，即土壤中總amoA基因豐度顯著正相關(guān)(r=0.40,P<0.05)。

2.3 氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)

氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的群落結(jié)構(gòu)以PCR-DGGE方法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有處理均容易獲得足量的AOA PCR產(chǎn)物用于DGGE電泳。DGGE圖譜及其對(duì)應(yīng)條帶的聚類分析結(jié)果顯示，對(duì)照處理Ctrol與其它施肥處理明顯分開，單獨(dú)成為一支，表明對(duì)照處理Ctrol土壤中AOA的群落結(jié)構(gòu)與其它處理存在明顯差異；所有施肥處理中，N處理與其它處理明顯分開，NP和NK，NPK+CaO和NPK，NK+CaO、NP+ CaO和N+CaO分別聚集成3個(gè)小分支(圖2)，表明AOA的群落組成在這3組處理中存在稍小差異。

圖2 不同土壤中氨氧化古菌amoA基因的DGGE圖譜及其UPGMA聚類分析Fig.2 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of ammonia-oxidizing archaeal amoA gene in soils

而對(duì)AOB來(lái)說(shuō)，施加CaO的所有處理均能獲得足夠的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳分析，但盡管使用同樣的PCR擴(kuò)增條件，對(duì)照處理土壤Ctrol及各施氮肥處理土壤中AOBamoA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較弱甚至擴(kuò)增不出，在DGGE圖譜上僅得到一些隨機(jī)條帶；與不施加CaO的處理相比，施加CaO的所有處理中AOB的DGGE條帶明顯增加，并顯示出較高的群落相似性，表明施加CaO明顯刺激了這部分氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)；此外，NPK+CaO處理土壤比N+CaO，NK+CaO，NP+CaO處理顯示出更高的組成多樣性(圖3)。對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行的聚類分析的結(jié)果也顯示，施N肥處理及對(duì)照處理與其它處理明顯分開，其余處理聚積于一大分支，其中添加CaO的4個(gè)處理又聚積成一個(gè)小分支，且NPK+CaO處理與N+CaO，NK+CaO，NP+CaO相互分開(圖3)。

圖3 不同土壤中氨氧化細(xì)菌amoA基因DGGE圖譜及其UPGMA聚類分析Fig.3 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of ammonia-oxidizing bacterial amoA gene in soils

3 討論

3.1 長(zhǎng)期施肥處理及添加CaO對(duì)土壤性質(zhì)和硝化作用的影響

3.2 氨氧化微生物對(duì)長(zhǎng)期施氮肥及添加CaO的響應(yīng)

在所有施肥處理土壤中，氨氧化古菌AOAamoA基因(7.40×107—4.08×108copies/g)的豐度均顯著高于氨氧化細(xì)菌AOB(1.67×106—2.57×107copies/g)，二者比值為10.9—44.3，這與2007年的調(diào)查結(jié)果一致，并與其他有關(guān)酸性土壤中AOA占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的研究結(jié)論相符[23-26]。已有的大量研究也表明，在大區(qū)域尺度上，pH值是驅(qū)動(dòng)氨氧化微生物多樣性分布及活性的主要因子[12]。Nicol等[11]對(duì)pH值梯度為4.9—7.5的草地土壤進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，AOA與AOB的數(shù)量比值隨pH值增加而降低，AOA的數(shù)量和amoA基因的表達(dá)活性隨土壤pH值增加明顯降低，而AOB則相反。作者及國(guó)內(nèi)其他研究者利用高通量測(cè)序技術(shù)及穩(wěn)定性同位素探測(cè)(SIP)等技術(shù)對(duì)我國(guó)一系列土壤開展的研究也發(fā)現(xiàn)，隨土壤pH值增加，AOA和AOB群落組成發(fā)生明顯演替；在北方堿性潮土中，氨氧化細(xì)菌是硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)者，而在南方酸性土壤中，硝化作用主要由氨氧化古菌所驅(qū)動(dòng)[13, 17, 27-28]。這些結(jié)果一致證實(shí)了AOA和AOB生態(tài)位分異的特征，即AOB傾向于在高氮及pH值中性或堿性的環(huán)境中起主導(dǎo)作用，而AOA則傾向于在酸性及低氮高有機(jī)質(zhì)的土壤中占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)[29-32]。

此外，還發(fā)現(xiàn)，NPK及NPK+CaO土壤中AOB和AOA群落結(jié)構(gòu)與其它處理土壤也有一定差異，這說(shuō)明P、K也會(huì)影響土壤氮循環(huán)過(guò)程及氨氧化微生物，這與之前一些研究報(bào)道結(jié)果一致[36-37]。

4 結(jié)論

本研究對(duì)長(zhǎng)期施加不同氮肥處理并添加CaO調(diào)節(jié)的酸性紅壤中硝化作用及氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度特征進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)施加含氮肥料可導(dǎo)致土壤pH值和硝化作用進(jìn)一步降低，添加CaO則可緩解土壤酸化，顯著提高土壤pH值和硝化潛勢(shì)。AOA的群落組成在長(zhǎng)期施肥處理與不施肥處理間有顯著不同，但在不同氮肥處理間無(wú)顯著差異。添加CaO處理對(duì)AOA的群落組成無(wú)顯著影響，但明顯提高了各施肥處理土壤中氨氧化細(xì)菌的豐度，并增加了其群落多樣性，氨氧化古菌的豐度受到一定程度的抑制。這些結(jié)果表明，雖然氨氧化古菌因自身的生理及遺傳特征更適應(yīng)在酸性土壤硝化作用中發(fā)揮作用，酸性土壤中AOB在功能上冗余，但當(dāng)添加CaO后，AOA和AOB對(duì)環(huán)境條件變化迅速作出響應(yīng)，并根據(jù)其不同的生態(tài)位需求重新分配優(yōu)勢(shì)地位，二者交替作用共同驅(qū)動(dòng)著酸性土壤的硝化作用。

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Effects of long-term N fertilizer application and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic soils

ZHANG Miaomiao1,2, WANG Boren3, LI Dongchu3, HE Jizheng1, ZHANG Limei1,*

1ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3RedSoilExperimentalStation(Qiyang,Hunanprovince),theMinistryofAgriculture,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Yongzhou426100,China

acidic soils; liming; nitrification; ammonia-oxidizing archaea (AOA); ammonia-oxidizing bacteria (AOB)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41171217, 41322007)

2014-02-26; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期:

日期:2014-12-04

10.5846/stxb201402260329

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhanglm@rcees.ac.cn

張苗苗，王伯仁，李冬初，賀紀(jì)正，張麗梅.長(zhǎng)期施加氮肥及氧化鈣調(diào)節(jié)對(duì)酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(19):6362-6370.

Zhang M M, Wang B R, Li D C, He J Z, Zhang L M.Effects of long-term N fertilizer application and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic soils.Acta Ecologica Sinica,2015,35(19):6362-6370.