環(huán)氧合酶-2在宮頸癌組織中的表達及對預(yù)后的影響

辛華棟 張莉華 田 芬 焦 茹 吳士茜 成艷梅

1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院婦二科，河北邯鄲 056001；3.河北省邯鄲市中心醫(yī)院婦一科，河北邯鄲 056001；4.河北省邯鄲市中心醫(yī)院體檢中心，河北邯鄲 056001；5.河北省邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北邯鄲 056001

隨宮頸癌篩查技術(shù)的臨床推廣及應(yīng)用，早期宮頸癌的治療滿意。 流行病學調(diào)查顯示：年輕宮頸癌的發(fā)病率近年呈增高趨勢。晚期及復發(fā)轉(zhuǎn)移宮頸癌仍面臨治療困難、生存質(zhì)量差的棘手問題，約60%的復發(fā)轉(zhuǎn)移病例在2 年內(nèi)死亡。而不良預(yù)后因素在臨床治療及病情監(jiān)測方面發(fā)揮著重要的指導作用。在分子水平對惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的研究成為近年腫瘤學研究的熱點領(lǐng)域。 COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶，在體內(nèi)呈誘導型表達。 多項研究顯示，在鼻咽癌[1]、食道癌[2]、胃癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、乳腺癌[5]、膀胱移行細胞癌[6]、非小細胞肺癌[7]等上皮惡性腫瘤中COX-2 蛋白或COX-2 mRNA 高表達，并與不良預(yù)后及生存率有關(guān)。 本研究旨在探討COX-2 與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008 年6 月～2009 年10 月在邯鄲市第一醫(yī)院及中心醫(yī)院住院治療的原發(fā)宮頸癌患者的蠟塊共95 例，臨床病理資料完整，排除合并其他惡性腫瘤及心腦血管疾病的患者，年齡27～80 歲，中位年齡42 歲。所有病理切片請兩位資深病理科醫(yī)師復核，按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO 2009）宮頸癌臨床分期標準[3]進行分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期43 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期9 例。 高、中、低分化（G1、G2、G3）分別為16 例、49 例及30 例。 鱗癌77 例，非鱗癌18 例（腺癌11 例，腺棘細胞癌5 例，小細胞未分化癌1 例，透明細胞癌1 例）。

1.2 實驗方法

采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結(jié)免疫組化（S-P）法進行實驗檢測。 基本原理是采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的抗原。羊抗人COX-2 多克隆抗體、鼠抗人HPV16-E6 單克隆抗體。即用型羊S-P kate 檢測試劑、即用型鼠S-P kate檢測試劑；DAB 顯色試劑盒、S-P 試劑盒均為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。 本實驗染色程序嚴格按S-P 染色試劑盒說明書操作。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷

COX-2 陽性判定標準：細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒為陽性表達。 根據(jù)文獻，按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分（immunohistochemical scores，IHS）[8]：IHS=a×b。a 為陽性細胞百分比，每張切片隨機選擇5 個高倍視野計數(shù)陽性細胞100 個，放大倍數(shù)10×40：a=0，無陽性細胞；a=1，陽性細胞為1%～10%；a=2，陽性細胞＞10%～50%；a=3，陽性細胞＞50%～80%；a=4，陽性細胞＞80%。b 代表陽性細胞染色強弱：b=0，陰性；b=1，弱陽性；b=2，中度陽性；b=3，強陽性。HIS 為0 分者計為陰性，≥1 分者計為陽性。將以已知COX-2 陽性的肺癌切片作為陽性對照。

1.4 隨訪

通過電話、門診復查、書信等方式對患者進行隨訪，從確診之日起，至2014 年10 月隨訪結(jié)束。生存期以月為計算單位，隨訪時間為8.6～76 個月。 隨訪期內(nèi)，95 例宮頸癌患者中死亡26 例，失訪3 例，其中9 例死于局部復發(fā)，8 例死于遠處轉(zhuǎn)移，7 例死于局部復發(fā)合并遠處轉(zhuǎn)移，1 例死于心肌梗死，1 例死于腦出血。 失訪者自失訪之日按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。Pearson 法及Spearman 等級相關(guān)檢驗進行雙變量相關(guān)性分析，以Kaplan-Meier 法計算生存率并繪制生存曲線，組間生存率的比較采用Log-rank 檢驗，Cox 比例風險模型進行宮頸癌預(yù)后的多因素分析。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2 在宮頸癌中的表達情況

COX-2 的總陽性表達率為65.26%（62/95），見圖1～2（封三）。 其在年齡、組織學分級、臨床分期、腫瘤直徑及病理類型各組中比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤及肌層浸潤深度各組中比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 相關(guān)分析顯示：COX-2 與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮旁或脈管浸潤呈正相關(guān)（r = 0.207、0.220、0.215，均P ＜0.05）。 見表1。

圖1 COX-2 在宮頸癌中的陰性表達（HE 染色，200×）

圖2 COX-2 在宮頸癌中的陽性表達（S-P 染色）

2.2 患者5 年生存率分析

95 例宮頸癌患者的5 年生存率為72.63%（69/95），生存時間最短8.6 個月，最長73 個月，中位生存時間54 個月。95 例宮頸癌患者的總生存曲線見圖3。

2.3 COX-2 對宮頸癌預(yù)后的單因素分析

COX-2 陽性患者的5 年生存率為61%，其中死亡23 例；COX-2 陰性患者的5 年生存率為91%，其中死亡3 例。 Log-rank 檢驗顯示：COX-2 陽性組的5 年生存率顯著低于陰性組（χ2=7.853，P ＜0.01），見表2。 生存曲線見圖4。

2.4 宮頸癌預(yù)后影響因素的多因素分析

將所有可能因素進行多因素分析結(jié)果顯示：COX-2、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及肌層浸潤深度對宮頸癌的預(yù)后均有影響差異統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），是獨立預(yù)后因素（P≤0.05 為進入水準，P ＞0.1為剔除水準）。 而年齡、組織學分級、病理類型、宮旁或脈管浸潤對宮頸癌的預(yù)后無統(tǒng)計學意義（P ＞0.1）。見表3。

表1 COX-2 與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系（n = 95）

表2 宮頸癌預(yù)后的單因素分析結(jié)果（n = 95）

表3 宮頸癌預(yù)后影響因素的多因素分析

圖3 95 例宮頸癌患者的總5 年生存率

圖4 COX-2 表達情況的生存曲線

3 討論

COX-2 是完整的膜結(jié)合蛋白，在大多數(shù)正常組織中不表達或微量表達，但在炎癥細胞因子、生長因子、促癌劑、一氧化氮、缺氧、癌基因活化等刺激下，可于短期內(nèi)上調(diào)20～40 倍，也被稱為即刻反應(yīng)基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。李媛媛等[9]對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)：免疫電鏡下COX-2 蛋白的膠體金顆粒定位于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上，這可解釋免疫組化染色為胞漿棕黃色著色。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜同屬于細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，COX-2 的定位提示：蛋白質(zhì)的合成及轉(zhuǎn)運，即通過多種信號轉(zhuǎn)導通路及復雜的分子機制在腫瘤形成過程中可能發(fā)揮了重要作用，目前多項體內(nèi)外實驗已做了初步探討[10-11]。

本研究中COX-2 陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤及深肌層浸潤組中的表達顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤及淺肌層浸潤組中，與前期研究一致[12]。相關(guān)分析顯示，COX-2 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤及腫瘤直徑呈正相關(guān)。 提示：在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中，COX-2 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤、肌層浸潤深度及腫瘤直徑密切相關(guān)。 局部直接浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸癌的主要轉(zhuǎn)移途徑，晚期出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移。 新生血管形成是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要前提，實體瘤內(nèi)微血管的數(shù)量及密度與腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能呈正相關(guān)關(guān)系。 淋巴管多位于腫瘤間質(zhì)內(nèi)。 新生血管及淋巴管雜亂密集，基底膜連續(xù)性差，功能不完善，利于腫瘤細胞進入脈管系統(tǒng)，從而發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。

一項直腸癌的研究顯示[13]，COX-2 與VEGF-C 表達呈線性關(guān)系，COX-2、VEGF-C 與微血管密度（MVD）及微淋巴管密度（MLVD）呈線性關(guān)系。 提示COX-2過表達可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）水平，進而誘導腫瘤組織中微血管及微淋巴管的生成，從而促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。 成旭惠等[14]在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)：COX-2 與VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）及MVD（微血管密度）呈正相關(guān)，VEGF 與COX-2 相互作用，誘導腫瘤新生血管生成，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 推測在宮頸癌中亦存在類似機制，促進腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、深部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移。在宮頸癌侵襲的分子機制中，COX-2/前列腺素E2（PGE2）與MMP（基質(zhì)金屬蛋白酶）相互上調(diào)，溶解細胞外基質(zhì)、破壞細胞間連接。 其中MMP-9能降解包括基底膜Ⅳ型膠原在內(nèi)的多種細胞外成分，使癌細胞向深層間質(zhì)浸潤，亦可突破淋巴管及血管的基底膜形成脈管浸潤，增加腫瘤細胞侵襲性。 研究發(fā)現(xiàn)[15]，COX-2 通過NF-κB/Snail 信號通路下調(diào)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達，致使細胞間粘附作用減弱。以上機制均可導致腫瘤上皮細胞間質(zhì)化（EMT），細胞結(jié)構(gòu)改變，極性喪失，與周圍細胞和基質(zhì)的接觸減少，獲得間質(zhì)細胞表型， 腫瘤細胞的遷移和運動能力增強，從而出現(xiàn)局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移。 COX-2 過表達可通過多種分子機制及多種信號轉(zhuǎn)導通路，增強宮頸癌細胞的侵襲性，使腫瘤細胞突破淋巴管及血管的脈管屏障，同時向間質(zhì)深部浸潤，促進癌灶的局部直接浸潤及遠處轉(zhuǎn)移，與宮頸癌的不良預(yù)后有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，COX-2 在組織學分級和臨床分期各組中陽性率均無差異，提示COX-2 表達與分化程度及分期無關(guān)，相關(guān)分析結(jié)果亦證實以上結(jié)論。 但COX-2 與分化及分期進行統(tǒng)計學分析時，等級相關(guān)系數(shù)為負數(shù)，提示隨著分化程度降低及臨床期別的升高，COX-2 的表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。即在宮頸癌Ⅰ、Ⅱ期及高分化病例中COX-2 已存在較高水平的表達，推測COX-2 表達上調(diào)是宮頸癌發(fā)生的早期事件。 這與張煥等[16]對非小細胞肺癌的研究結(jié)果相似。 前期研究顯示，在宮頸癌前病變時COX-2 的表達上調(diào)已有統(tǒng)計學意義，與HPV16-E6、E7 蛋白協(xié)同作用促使增生活躍的宮頸上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化，突破基底膜，形成浸潤癌。 鄧星輝[17]等對胃癌的研究亦認為在不典型增生階段COX-2 高表達已存在，支持本研究結(jié)論。

本研究顯示，宮頸癌的總體5 年生存率為72.63%，隨臨床期別的增加，5 年生存率依次遞減，分別為84%、81%、55%及33%。 COX-2 表達陽性者5 年生存率為61%， 陰性者為91%， 經(jīng)Log-rank 檢驗有顯著性差異。多因素分析COX-2 亦有統(tǒng)計學意義。提示COX-2 為宮頸癌預(yù)后的影響因素，與宮頸癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。 袁冬蘭等[18]的研究結(jié)果與之相似。 國內(nèi)外研究 報 導[4，7，19]：在卵巢癌、結(jié)直腸 癌 及非小 細 胞 肺 癌 中COX-2 均為不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素， 并且在免疫組化水平和血清檢測中結(jié)果相似。本研究單因素分析顯示：除COX-2 外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤、腫瘤直徑、臨床分期及組織學分級均與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)。 結(jié)合臨床，進行多因素分析顯示，COX-2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度、腫瘤直徑、臨床分期為宮頸癌的獨立預(yù)后因素。單因素分析中宮旁或脈管浸潤及分化程度的累積5 年生存率有顯著性差異，宮頸癌不良預(yù)后密切相關(guān)，但多因素分析中未進入COX 回歸模型的方程中。 而肌層浸潤深度的5 年生存率的Logrank 檢驗無統(tǒng)計學意義，但在P≤0.05 為進入水準的多因素分析中成為獨立預(yù)后因素。 分析原因，影響宮頸癌預(yù)后的因素多樣而復雜， 且通過多種分子機制、信號轉(zhuǎn)導通路增加癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能，各個因素在此過程中發(fā)揮權(quán)重不盡相同，還有待進一步深入研究其具體機制。 其二本研究入選病例有限，可能影響分析結(jié)果，期待大樣本的預(yù)后分析研究。

國內(nèi)多認為臨床分期高、組織分化差及淋巴結(jié)陽性的病例預(yù)后差。 而國外文獻報道間質(zhì)深浸潤、脈管浸潤以及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌預(yù)后的3 大病理高危因素。 由此可見，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素。本研究數(shù)據(jù)顯示淋巴結(jié)陽性病例的死亡風險是陰性者的5.937 倍，COX-2 陽性的死亡風險是陰性者的3.723 倍，生存曲線可直觀反映COX-2 對宮頸癌不良預(yù)后的影響。 國外研究亦顯示，COX-2 高表達患者的5 年生存率顯著低于低表達者[20]。 國內(nèi)研究顯示：COX-2 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及組織學分級有關(guān)[19，21]，并與腫瘤浸潤深度呈正相關(guān)[22]。COX-2 表達陽性者，其微淋巴管密度和微血管密度顯著高于陰性者[23]，一方面為腫瘤病灶的生長提供營養(yǎng)，一方面通過促進基質(zhì)金屬蛋白酶及CD44 活化，下調(diào)E-cadherin蛋白，增加腫瘤細胞的侵襲力。宮頸腫瘤直徑越大，分化越差，期別越晚，COX-2 陽性表達率高，在分子機制水平發(fā)揮作用，致使通過宮旁新生毛細血管及淋巴管浸潤轉(zhuǎn)移的概論越高，出現(xiàn)深肌層浸潤、脈管瘤栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概論越高，從而影響患者的預(yù)后。

綜上所述，COX-2 與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁或脈管浸潤、肌層浸潤深度及腫瘤直徑密切相關(guān)，在侵襲、演進及遠處轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為中發(fā)揮了重要的作用，且是宮頸癌不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素，可作為預(yù)后監(jiān)測的指標之一。 臨床需重視淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁浸潤、脈管瘤栓、深肌層浸潤、腫瘤病灶大、分期晚、分化差等高危因素的病例，結(jié)合COX-2 的檢測，對評估預(yù)后及指導治療具有重要的臨床價值。近年研究發(fā)現(xiàn)COX-2 抑制劑能使多種腫瘤細胞如宮頸癌Hela細胞系體外增殖受限。 有研究顯示[24]，COX-2 抑制劑塞來昔布，已進行Ⅲ期臨床試驗，以減少結(jié)腸癌的發(fā)生。 COX-2 抑制劑作為宮頸癌放化療的增敏劑，有學者已進行了初步探討。 筆者推測COX-2 作為宮頸癌的靶點治療將發(fā)揮積極的作用，期待COX-2 抑制劑臨床實驗的推廣，本研究為此提供了理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

[1] Kim TJ，Lee YS，Kang JH，et al. Prognostic significance of expression of VEGF and COX-2 in nasopharyngeal carcinoma and its association with expression of ERBB2 and EGFR [J]. Surg Oncol，2011，103（1）：46-52.

[2] 白美玲，張林西，李海軍，等.Ang-2、COX-2 及CD105 聯(lián)合檢測評價食管鱗癌患者預(yù)后的意義[J].中國老年學雜志，2012，32（11）：2238-2240.

[3] Hu Z，Liu X，Tang Z，et al. Possible regulatory role of Snail in NF-κB-mediated changes in E-cadherin in gastric cancer [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：993-1000.

[4] 謝竹田，張彧飛，姜文潔，等.環(huán)氧合酶-2 表達與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系的Meta 分析[J].齊魯醫(yī)學雜志，2014，29（3）：192-195.

[5] Steenport M，Khan KM，Du B，et al. Matrix metalloproteinase（MMP）-1 and MMP-3 induce macrophage MMP-9：evidence for the role of TNF-alpha and cyclooxygenase-2 [J]. J Immunol，2009，183（12）：8119-8127.

[6] 高放，何靜華，張鳳梅，等.nm23、COX-2 與MMP-9 與膀胱癌中的表達及其與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中外醫(yī)療，2012，1（13）：26-28.

[7] Jiang H，Wang J，Zhao W. COX-2 in non-small cell lung cancer：a meta-analysis [J]. Chin Chin Acta，2013，41（9）：26-32.

[8] 歐陽艷瓊，吳緒峰，陳惠禎，等.宮頸癌組織中環(huán)氧合酶-2 和誘生型一氧化氮合酶的表達及其意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2003，12（5）：363-365.

[9] 李媛媛，劉雨清，吳洪娟.COX-2 在乳腺癌組織中的超微結(jié)構(gòu)定位及其意義[J].中國醫(yī)藥導報，2010，7（10）：35-38.

[10] 趙婷婷，凌斌，馮定慶，等.NS-398 抑制SKOV3 細胞惡性生物學特性的機制[J].安徽醫(yī)科大學學報，2014，49（9）：1210-1213.

[11] Hiroko O，Masanobu O. The role of PGE2-associated inflammatory responses in gastric cancer development [J].Springer-Verlag Berlin Heidelberg，2013，35（2）：139-150.

[12] 張莉華，田芬，辛華棟，等.COX-2 在宮頸癌變中的表達及其意義[J].河北醫(yī)科大學學報，2010，31（5）：578-580.

[13] 王愛亮，劉志強，陸信仰，等.直腸癌中環(huán)氧化酶2、血管內(nèi)皮生長因子C 的表達及與血管生成、淋巴管生成相關(guān)性的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012，6（5）：1300-1302.

[14] 成旭惠，歐希龍，宋永謙，等.COX-2 及VEGF 在胃癌中的表達及臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥，2012，40（17）：2034-2036.

[15] Liu XJ，Chen ZF，Li HL，et al. Interaction between Cyclooxygenase-2，Snail，and E-cadherin in gastric cancer cells [J].World J Gastroenterol，2013，19（37）：6265-6271.

[16] 張煥，仝磊，姬文莉，等.非小細胞肺癌組織中COX-2的表達及其與臨床病理的關(guān)系[J].新疆醫(yī)學，2014，44（17）：17-21.

[17] 鄧星輝，黎紅，周偉.COX-2 和MMP-9 在胃癌組織中的表達及意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49（12）：234-245.

[18] 袁冬蘭，錢華，王華，等.宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2、VEGF 的表達及其臨床意義[J].江蘇大學學報，2014，24（3）：250-254.

[19] 劉曉麗，馬禮鴻，王全義，等.COX-2、ERCC-1 在卵巢癌組織中的表達及意義[J].中國病原生物學雜志，2013，8（8）：739-741.

[20] Saba NF，Choi M，Muller S，et al. Role of Cyclooxygenase-2 in tumor progression and survival of head and neck squamous cell carcinoma[J].Cancer Prev Res，2009，2（9）：823-829.

[21] 王蘊眾.Survivin 和Cox-2 在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2013，21（11）：2448-2450.

[22] 陸曉峰，陳剛.胃癌組織中PCNA、COX-2、p53 及RGFR的表達及其與預(yù)后的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2012，52（41）：39-41.

[23] 張煥，楊麗麗，房新志.非小細胞肺癌組織中COX-2 表達及其與微血管和微淋巴管密度的關(guān)系[J].新疆醫(yī)科大學學報，2011，34（6）：591-597.

[24] Benelli R，Vene R，Minghelli S，et al. Celecoxib induces proliferation and Amphiregulin production in colon subepithelial myofibroblasts，activatingerk1-2 signaling in synergy with EGFR[J].Cancer Lett，2013，328（1）：73-82.