毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定注射用利培酮微球中有機(jī)溶劑殘留量

馬建芳，朱瀛華，任飛亮，劉 蔚，彭興盛，陳桂良

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 200131)

注射用利培酮微球(商品名恒德? )是由美國(guó)楊森公司研發(fā)生產(chǎn)的首個(gè)長(zhǎng)效非典型性抗精神病藥物，結(jié)合了長(zhǎng)效劑型和非典型抗精神病藥的優(yōu)勢(shì)，可顯著改善精神分裂癥引起的陽(yáng)性癥狀和陰性癥狀[1-2]，具有用藥次數(shù)少、可持續(xù)釋放藥物、血藥濃度平穩(wěn)、不良反應(yīng)發(fā)生率低、有效性和安全性高、患者依從性和耐受性好的優(yōu)點(diǎn)[3]，被廣泛應(yīng)用于臨床。利培酮微球制備過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑包括乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇，在微球固化成型過(guò)程中，致密堅(jiān)硬的高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物可阻礙有機(jī)溶劑的揮發(fā)，造成有機(jī)溶劑殘留[4-5]。殘留的有機(jī)溶劑會(huì)引起患者注射部位刺激或疼痛，影響藥物在體內(nèi)的釋放，從而影響藥效，因此應(yīng)控制利培酮微球中的殘留溶劑，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，保證用藥安全。2010 年版《中國(guó)藥典(二部)》中規(guī)定，乙醇和乙酸乙酯是第3 類溶劑，限度為0.5%，未對(duì)苯甲醇的限度作要求。本研究中建立了可同時(shí)測(cè)定注射用利培酮微球中的殘留溶劑乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇含量的毛細(xì)管氣相色譜法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可作為利培酮微球中有機(jī)溶劑殘留量檢測(cè)的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

6890A 型氣相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)。注射用利培酮微球(美國(guó)楊森公司，批號(hào)為DJZSW00，DKZSG00，DKZSS00);乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇、苯乙醇和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:DB-624 型毛細(xì)管柱(94 %二甲基聚硅氧烷和6 %氰丙基苯聚硅氧烷，320 μm×30 m，1.8 μm);氫火焰離子化檢測(cè)器(FID):檢測(cè)器溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，氦氣為載氣，采用恒流模式，流速為1.0 mL/min，氫氣流速為35 mL/min，空氣流速為350 mL /min，尾吹氣流速為25 mL /min;進(jìn)樣量:3 μL;分流比:10 ∶1;分析方法:程序升溫，初始柱溫130 ℃，平衡5 min，以70 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，平衡10 min。取對(duì)照品溶液依法進(jìn)樣測(cè)定，乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇的理論板數(shù)均大于5 000，各有機(jī)溶劑色譜峰完全分離，分離度均大于2.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液制備

取DMF 適量，置1 000 mL 容量瓶中，加乙酸丙酯25 μL 和苯乙醇150 μL，用DMF 稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液，其中乙醇和乙酸乙酯以乙酸丙酯為內(nèi)標(biāo)，苯甲醇以苯乙醇為內(nèi)標(biāo)。取內(nèi)標(biāo)溶液適量，置100 mL 容量瓶中，精密稱取乙醇155.49 mg、乙酸乙酯50.49 mg 和苯甲醇177.54 mg，置100 mL 容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液5 mL，置50 mL 容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，制成乙醇155.49 μg/mL、乙酸乙酯50.49 μg/mL 和苯甲醇177.54 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密稱取樣品內(nèi)容物100 mg，置10 mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液約7 mL，超聲10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室溫，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):取上述5 種溶劑適量，分別置10 mL 容量瓶中，加入DMF 稀釋至刻度，搖勻，作為5 種溶劑的定位溶液。將上述定位溶液分別注入氣相色譜儀，按擬訂色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果出峰順序依次為乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇，定位溶液中各組分的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中各組分保留時(shí)間一致，表明專屬性較強(qiáng)。

線性關(guān)系考察:分別精密量取對(duì)照品貯備液0.25，0.50，1.00，2.00，2.50，5.00，6.00，7.50 mL，各置50 mL 容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以各個(gè)殘留溶劑的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)主峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)(乙醇和乙酸乙酯以乙酸丙酯為內(nèi)標(biāo)，苯甲醇以苯乙醇為內(nèi)標(biāo))進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，詳見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn):取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次。計(jì)算得乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD分別為2.63%，1.91%，0.94% ( n=6)，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn):分別精密量取對(duì)照品貯備液2.50，5.00，7.50 mL，各置已精密稱取注射用利培酮微球內(nèi)容物500 mg 的50 mL 容量瓶中，各3 份，加內(nèi)標(biāo)溶液約35 mL，超聲10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室溫，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為低、中、高濃度供試品溶液。另精密稱取本品500 mg，置50 mL 容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液約35 mL，超聲10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室溫，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為空白對(duì)照溶液。按擬訂色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 氣相色譜圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果及回歸方程(μg/mL)

穩(wěn)定性試驗(yàn):按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，6，12，24，36，48 h 時(shí)依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD 分別為3.43%，1.52%，1.02%(n=7)，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表2 乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定

按2.2 項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，按擬訂色譜條件分別依法進(jìn)樣測(cè)定，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(%)

3 討論

進(jìn)樣方式和溶劑選擇:微球的固化成型可能會(huì)影響制備過(guò)程中所用有機(jī)溶劑的揮發(fā)，殘留的有機(jī)溶劑可影響藥物穩(wěn)定性，且增加毒副作用，故殘留的有機(jī)溶劑量不應(yīng)超過(guò)2010 年版《中國(guó)藥典(二部)》的限量規(guī)定[6]。殘留溶劑測(cè)定方法中，常用的進(jìn)樣方式主要有頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣。本試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，采取直接進(jìn)樣法時(shí)，乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇的分離度較好，各組分間不相互干擾，靈敏度高，相較頂空進(jìn)樣，可避免頂空沒(méi)有完全平衡和頂空進(jìn)樣等帶來(lái)的測(cè)定誤差，且頂空進(jìn)樣裝置容易引起乙醇和苯甲醇的殘留，故本方法采用溶液直接進(jìn)樣。直接進(jìn)樣時(shí)，樣品應(yīng)完全溶解于溶劑中，經(jīng)試驗(yàn)，利培酮微球中的主要輔料高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物可完全溶解于DMF 中，DMF 的沸點(diǎn)較高，很少干擾其他殘留溶劑的檢查。結(jié)果表明，采用直接進(jìn)樣法，利培酮微球中的輔料及溶劑DMF 對(duì)被測(cè)溶劑及內(nèi)標(biāo)物均無(wú)干擾，各組分峰之間的分離度均大于2.5。

色譜柱選擇:預(yù)試驗(yàn)中比較了不同極性的毛細(xì)管色譜柱的分離效果，由于5 個(gè)溶劑的極性有較大區(qū)別，HP-1 和HP-5 等非極性色譜柱和DB-WAX 等極性色譜柱的分離效果均不理想，而中等極性色譜柱DB-624 對(duì)各溶劑峰的分離效果最優(yōu)，且待測(cè)組分靈敏度高。在極性差異的基礎(chǔ)上，考慮到各個(gè)溶劑的沸點(diǎn)差異，為實(shí)現(xiàn)各色譜峰的有效分離并盡量縮短分析時(shí)間，采用了程序升溫的方法。比較了不同的起始柱溫(120，130，140，150，160，170，180 ℃)和不同的升溫速率(40，50，60，70，80 ℃/min)條件下各溶劑峰的分離效果。結(jié)果，130 ℃保持5 min 可使低沸點(diǎn)的乙醇、乙酸乙酯和乙酸丙酯盡早出峰并有效分離，然后以70 ℃/min的速度升溫至240 ℃保持10 min 的程序升溫條件，可顯著縮短高沸點(diǎn)溶劑苯甲醇和苯乙醇的出峰時(shí)間，基線漂移范圍小，可顯著改善峰形，各溶劑峰均得到有效分離，避免微球輔料在毛細(xì)管柱中殘留的現(xiàn)象出現(xiàn)。

定量方式選擇:內(nèi)標(biāo)法可避免樣品處理或進(jìn)樣體積誤差對(duì)結(jié)果的影響，在測(cè)定揮發(fā)性殘留溶劑時(shí)定量較準(zhǔn)確。內(nèi)標(biāo)物應(yīng)不干擾被測(cè)物的出峰，響應(yīng)較好，為保證內(nèi)標(biāo)物的定量準(zhǔn)確，內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間應(yīng)盡可能與被分析物質(zhì)接近。苯甲醇的沸點(diǎn)顯著高于乙醇和乙酸乙酯，為保證定量準(zhǔn)確，分別采用乙酸丙酯和苯乙醇作為乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇的內(nèi)標(biāo)，定量準(zhǔn)確。結(jié)果表明，各殘留溶劑的線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度高，回收率符合要求。

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