丹酚酸A對H2O2所致大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

易志紅 白洋 陳立蓀 徐峰 陳利江

丹酚酸A對H2O2所致大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

易志紅 白洋 陳立蓀 徐峰 陳利江

目的 觀察丹酚酸A對H2O2所致大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RCMECs）氧化損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用H2O2損傷的方法建立氧自由基損傷模型。采用丹酚酸A進(jìn)行干預(yù)后，分別測定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性、血栓素B2（TXB2）水平、6-酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）的含量，以及細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果 H2O2致RCMECs氧化損傷后，細(xì)胞LDH釋放水平、TXB2和MDA的含量均明顯增加，同時(shí)6-keto-PGF1α含量和SOD活性顯著下降；而丹酚酸A預(yù)處理后能呈濃度依賴性的降低RCMECs氧化損傷后LDH水平、TXB2含量和細(xì)胞內(nèi)外的MDA含量，提高受損細(xì)胞6-keto-PGF1α的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)外SOD活性。結(jié)論 丹酚酸A對H2O2所致RCMECs氧化損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

丹酚酸A H2O2氧自由基損傷 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與組織間進(jìn)行物質(zhì)交換的屏障，其能分泌和釋放多種生物活性物質(zhì)，參與多種生理和病理過程[1-2]。在腦缺血損傷時(shí)，H2O2造成的氧化應(yīng)激效應(yīng)可直接導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而觸發(fā)漸進(jìn)性的缺血后低灌注，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致繼發(fā)性大腦或脊髓組織退變[3-4]。尋找能對抗缺血性腦血管疾病所致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基損傷的藥物具有重要的臨床意義。丹酚酸A是從丹參中提取的一種水溶性成分，對缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其對抗氧化損傷，穩(wěn)定線粒體膜有關(guān)，但目前對于丹酚酸A在腦血管缺血損傷保護(hù)中的作用及機(jī)制尚不清楚[5-6]。本研究采用大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RCMECs）氧化損傷模型，研究了丹酚酸A對RCMECs氧化損傷的保護(hù)作用，希望為丹酚酸A用于缺血性腦血管疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 RCMECs由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，丹酚酸A（批號：130821）購于上海友思生物技術(shù)有限公司；含酚紅及不含酚紅的M199干粉培養(yǎng)基和Ⅱ型膠原酶購于Gibco公司；新生小牛血清購于杭州四季青生物技術(shù)研究所；30%H2O2溶液于臨用前稀釋配制；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：20131222）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20130516）和丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20130820）購于南京建成生物工程研究所；6-酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）測試盒（批號：20140526）及血栓素B2（TXB2）測試盒（批號：20140321）購于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體（批號：ZA-0321）購于北京中山公司；Edaravone（批號：1138017）購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 H2O2損傷 RCMECs模型的建立和實(shí)效分析RCMECs的原代培養(yǎng)、傳代及鑒定參照參考文獻(xiàn)[7]，并采用MTT比色法確定適宜的H2O2濃度及孵育時(shí)間：RCMECs按1×105/孔培養(yǎng)于96孔板中，待其貼壁后分別加入不含酚紅的M199培養(yǎng)液配置的H2O2，使其終濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mmol/L的溶液，并分別在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5、1、2和4h。采用MTT法，用酶標(biāo)儀在490nm波長下測定吸光度值，并根據(jù)結(jié)果選擇最適宜的H2O2濃度和孵育時(shí)間。其中H2O2濃度測定按Spitz的方法[8]進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組 取第2～8代RCMECs按1×105/孔培養(yǎng)于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后生長至亞融合狀態(tài)時(shí)換成無血清培養(yǎng)基作用12h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為4組：正常組、損傷組、給藥組、對照組。其中正常組不加任何處理因素；損傷組根據(jù)最適宜的H2O2濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行造模；給藥組預(yù)先給予2.5、5.0、10μmol/L丹酚酸A（分別設(shè)為給藥組1、給藥組2、給藥組3），對照組則預(yù)先給予0.4μmol/l自由基清除劑edaravone，分別孵育20h后，與損傷組一起根據(jù)最適宜H2O2濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行造模，并檢測下述指標(biāo)。

1.2.3 RCMECs培養(yǎng)液中LDH活性、TXB2以及6-keto-PGF1α含量的檢測 取上述4組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液各100μl，按照檢測試劑盒說明，分別采用比色法檢測RCMECs培養(yǎng)液中的LDH活性，采用放射性免疫法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中血栓素A2的最終代謝產(chǎn)物TXB2的水平和前列環(huán)素最終代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α的含量。

1.2.4 RCMECs培養(yǎng)液中SOD活性的檢測 采用黃嘌呤氧化酶法分別對各組細(xì)胞SOD的吸光度值進(jìn)行檢測并計(jì)算其活性。將各組細(xì)胞移入離心管中，每管細(xì)胞數(shù)（1～2）×105個(gè)，200×g離心10min，棄上清液；沉淀中加入0.6ml冰三蒸水，旋渦振蕩混勻1min；加入0.3 ml無水乙醇，混勻30s；加入三氯甲烷0.3ml，混勻1 min；200×g離心10min；吸取上層抽提液100μl，并按照SOD測定試劑盒說明，比色法檢測各組細(xì)胞內(nèi)SOD的吸光度值并計(jì)算其活性。

1.2.5 RCMECs培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的檢測 MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸法。取上清液200μl，按照MDA測定試劑盒說明，以比色法在532 nm處測定吸光度值，并計(jì)算培養(yǎng)液中MDA的的含量。細(xì)胞內(nèi)MDA含量的檢測方法同細(xì)胞內(nèi)SOD活性測定方法。取抽提液300μl，按照MDA測定試劑盒說明，比色法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA的吸光度值并計(jì)算其含量。以上步驟重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 H2O2致RCMECs氧化損傷的時(shí)效、量效分析 見表1。

表1 H2O2致RCMECs氧化損傷的時(shí)效、量效分析

由表1可見，不同濃度H2O2干預(yù)者的吸光度值均顯著低于0mmol/L者（P＜0.01）；且RCMECs的活性隨著H2O2濃度增加及作用時(shí)間的延長逐漸降低。由此，實(shí)驗(yàn)最終選取了0.125 mmol/L H2O2作用0.5h作為最適的造模條件，這一條件一方面可以縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，另一方面能使損傷后細(xì)胞活力有效降至正常組50%左右。

2.2 丹酚酸對抗氧化損傷的結(jié)果 見表2。

由表2可見，（1）H2O2損傷組細(xì)胞LDH釋放量較正常組明顯增加（P＜0.01）。與損傷組相比，各給藥組經(jīng)丹酚酸A、對照組經(jīng)edaravone預(yù)處理后，均使H2O2所致RCMECs損傷后LDH的釋放顯著降低（P＜0.05或0.01），并隨著丹酚酸A濃度的升高其作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性；（2）H2O2致RCMECs氧化損傷后，細(xì)胞培養(yǎng)液中TXB2的含量顯著性增加（P＜0.01）。各給藥組丹酚酸A和對照組edaravone預(yù)處理后，均使H2O2所致細(xì)胞培養(yǎng)液中TXB2的含量明顯降低（P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴性；同時(shí)，H2O2能顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞6-keto-PGF1α的表達(dá)（P＜0.01），而丹酚酸A預(yù)處理則可有效降低H2O2對6-keto-PGF1α表達(dá)的抑制作用（P＜0.01），且呈濃度依賴；（3）H2O2可致細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中MDA含量較正常組顯著升高（P＜0.01）。而5μmol/L和10μmol/L丹酚酸A給藥組，以及對照組則可有效降低MDA含量（P＜0.05）；（4）H2O2能顯著抑制RCMECs細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中SOD活性（P＜0.01）。不同給藥組丹酚酸A和對照組edaravone預(yù)處理后，均可使H2O2作用后細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中SOD的活性明顯提高（P＜0.01），并呈現(xiàn)濃度依賴性。

表2 丹酚酸對抗氧化損傷的結(jié)果

3 討論

目前己知氧自由基引發(fā)的過氧化反應(yīng)是缺血性腦損傷的重要機(jī)制之一[9-10]。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，故不發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)和組織損傷。腦缺血發(fā)作時(shí)，腦細(xì)胞生物氧化功能發(fā)生異常，產(chǎn)生大量自由基，自由基氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管基底膜和腦細(xì)胞，造成毛細(xì)血管通透性增高和細(xì)胞功能障礙等[9-10]。本研究中我們采用H2O2作為外源性自由基生成系統(tǒng)，成功建立了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RCMECs）過氧化損傷模型。同時(shí)，為進(jìn)一步分析丹酚酸A在RCMECs氧化損傷中的保護(hù)作用和機(jī)制，我們重點(diǎn)對氧化損傷過程中幾個(gè)重要指標(biāo)進(jìn)行了評測。

MDA是自由基對內(nèi)皮細(xì)胞損害后，引起生物膜上不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，常用來反映組織脂質(zhì)過氧化損傷的程度[9-10]。而SOD作為目前發(fā)現(xiàn)的人體唯一的負(fù)氧離子天然酶類清除劑，其活性高低亦可間接反映組織自由基的含量[11-12]。測定MDA和SOD水平不僅可反映內(nèi)皮損傷的原因而且還可判斷內(nèi)皮損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2損傷RCMECs后，SOD活性顯著降低而MDA含量顯著升高，這在一定程度上也表明了該細(xì)胞氧化損傷模型的有效性。而丹酚酸A預(yù)處理則可增加培養(yǎng)液中及細(xì)胞內(nèi)SOD活性，降低MDA水平。該結(jié)果提示丹酚酸A對內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用可能與其抗過氧化損傷作用有關(guān)。

LDH水平的增高是細(xì)胞受損的一個(gè)敏感指標(biāo)，它能一定程度上反映細(xì)胞的損傷程度。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2可顯著的增加RCMECs中LDH的釋放水平，同時(shí)，丹酚酸A可呈濃度依賴性的減少H2O2所致RCMECs的LDH過度釋放，一定程度上顯現(xiàn)了其對氧化損傷的保護(hù)作用。

RCMECs不僅是血腦屏障的重要組成部分，還可釋放多種生物活性物質(zhì)如PGI2和TXA2等參與多種生理和病理過程[13]。其中PGI2是花生四烯酸經(jīng)PGI2合成酶催化合成的一種重要血管活性物質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板黏附、聚集，以及抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基等作用。TXA2是前列腺素H2（PGH2）經(jīng)TXA2合成酶催化合成的代謝產(chǎn)物，具有收縮腦血管、促進(jìn)血小板黏附、聚集的作用。PGI2和TXA2互相制衡，維持著正常腦微循環(huán)及腦血管內(nèi)皮功能。而H2O2一方面通過增強(qiáng)環(huán)氧酶的活性，刺激RCMECs分泌TXA2，并抑制PGI2合成酶的活性，使PGI2合成減少，從而打破PGI2和TXA2之間的平衡；另一方面，H2O2還可通過Fenton反應(yīng)生成超氧陰離子氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使的PGI2/TXA2失衡，引起血小板聚集及腦微循環(huán)障礙，加重腦缺血癥狀。由于PGI2和TXA2半衰期極短，因此，我們分別測定了其穩(wěn)定代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α與TXB2，間接反映兩者的實(shí)際水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，H2O2損傷后6-keto-PGF1α含量降低而TXB2含量則升高，兩者比值亦顯著降低；而丹酚酸A預(yù)處理能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷后6-keto-PGF1α的降低，并抑制TXB2含量的增高，進(jìn)一步提示丹酚酸A對H2O2所致過氧化損傷的RCMECs具有保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在成功建立大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A對H2O2所致RCMECs損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與丹酚酸A的抗氧化作用有關(guān)。

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Protective effects of salvianol acid A on hydrogen peroxide-induced oxidative injury of rat cerebral microvascular endothelial cells

YI Zhihong，BAI Yang，CHEN Lisun，et al.
Department of Internal Medicine-Neurology,Keqiao Traditional Chinese Medicine Hospital, Shaoxing 312030,China

【 Abstract】 Objective To investigate the protective effects of salvianol acid A(Sal A)on hydrogen peroxide-induced oxidative injury in rat cerebral microvascular endothelial cells(RCMECs). Methods RCMECs were isolated and cultured;the cultured cells were treated with hydrogen peroxide to induce the oxidative injury.Different concentrations of SalA were added in cell culture to intervene the cell injury.Lactate dehydrogenase(LDH),malondialdelyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)activities were measured by automatic biochemistry analyzer.Radioimmunoassay was applied to measure the thromboxane B2 (TXB2)and 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α). Results After incubated with 0.125 mmol/L hydrogen peroxide for 0.5 h,the viability of RCMECs was significantly inhibited,the LDH,MDA and TXB2 levels in culture supernatant were significantly increased,while 6-keto-PGF1α and SOD levels were decreased.Pre-incubated with different concentrations of SalA for 20h significantly decreased the levels of LDH,MDA and TXB2,and increased 6-keto-PGF1α level and the activity of SOD. Conclusion SalA can protect RCMECs against hydrogen peroxide-induced injury in a concentration-dependent manner,which may be associated with its antioxidant effects.

Salvianol acid A Hydrogen peroxide Oxygen free radical injury Cerebral microvascular endothelial cell

2014-08-20）

（本文編輯：楊麗）

312030 紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（易志紅、陳立蓀、徐峰、陳利江）；正大青春寶藥業(yè)有限公司研究所（白洋）

白洋，E-mail：1651937146@qq.com