慢性丙型肝炎中醫(yī)證型與HCV 1b亞型NS5A aa變異、IL28B SNP的關(guān)系

李京濤，魏海梁，席 奇，劉亞珠，閆曙光，惠 毅，宋春榮，寧春茜，常占杰

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000;2.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712000)

聚乙二醇化干擾素(pegylated interferon，PEGIFN)聯(lián)合利巴韋林(Ribavirin，RBV)治療是目前慢性丙型肝炎(CHC)患者的標(biāo)準(zhǔn)抗病毒方案。但此方案對HCV lb亞型的療效不佳，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(SVR)僅約55%［1］。結(jié)合病毒和宿主兩方面的關(guān)鍵因素分析，HCV 1b亞型病毒株基因NS5A蛋白多個區(qū)域的氨基酸(amino acid，aa)序列突變數(shù)目與IFN、IFN/RBV 的療效 有關(guān)，這 些 區(qū)域 包 括 ISDR［2］、PKRBD［3］、V3［4］、IRRDR［5-6］;而 人 19 號 染 色 體，IL28B上游rs12979860和rs8099917基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與抗病毒治療的SVR密切相關(guān)［7-9］。中醫(yī)藥在慢性丙型肝炎的臨床診療中發(fā)揮著重要作用［10-11］。傳統(tǒng)的中醫(yī)辨證論治是通過對四診所收集的資料，進(jìn)行歸納分析、綜合，概括、判斷為某種證，并確立相應(yīng)的治療方法。但是，慢性肝病的證候演化復(fù)雜多變，在眾多“顯性證候”之外，更多的是“隱性證候”［12］，因此，開展慢性肝病的證候客觀量化研究符合現(xiàn)代中醫(yī)藥臨床和科研發(fā)展的趨勢。筆者探索性地將慢性丙型肝炎的傳統(tǒng)中醫(yī)分型與影響HCV 1b亞型抗病毒療效的NS5A aa變異、IL28B SNP檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，探討其是否存在相關(guān)性。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 58例慢性丙型肝炎患者均為2012年7月—2014年7月在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診及住院的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)參考《丙型肝炎防治指南》［1］中的慢性丙型肝炎:HCV感染超過6個月，或發(fā)病日期不明、無肝炎史，但肝臟組織病理學(xué)檢查符合慢性肝炎，化驗(yàn)結(jié)果顯示HCV RNA＞1 000 U/mL(深圳匹基)，抗-HCV陽性。入組的患者均需經(jīng)過治療前評估:包括患者的年齡、性別、感染途徑等。

1.2 研究方法 慢性丙型型病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照“國家十一五科技重大專項(xiàng)課題”結(jié)果［13］，將慢性丙型肝炎患者中醫(yī)證型概括為以下6種:正虛邪戀、脾腎陽虛、濕熱中阻、肝郁脾虛、肝腎陰虛和瘀血阻絡(luò)。辨證分型結(jié)論由2位主治醫(yī)師共同判斷，并由1位主任醫(yī)師審核確定。

1.3 觀察指標(biāo) 1)肝臟生化指標(biāo):谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽紅素(TBIL)。由HITACHI 7600-020全自動生化分析儀完成。2)HCV RNA:采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測血清HCV RNA定量，儀器為ABl7300，試劑由深圳匹基基因公司提供，檢測下限為1 000 U/mL。3)HCV基因分型:HCV-1b亞型按文獻(xiàn)［14］方法確定。4)HCV NS5A的擴(kuò)增和序列比對:RT-PCR檢測患者血清中HCV NS5A片段，RT-PCR反應(yīng)條件和引物采用筆者已經(jīng)建立的方法［15］。陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海英駿公司測序。測序結(jié)果經(jīng)MEGA 4軟件進(jìn)行DNA序列比對，參考序列為HCV 1b原始株(HCV J，Gen-Bank 90208)，繼之轉(zhuǎn)換成 NS5A aa序列(aa 2209-2379)，分析 ISDR、PKRBD、V3、IRRDR 和 NS5A(ISDRV3)區(qū)突變情況。5)IL28B SNP檢測:采用四引物擴(kuò)增受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng)(tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，TARMS-PCR)擴(kuò)增rs8099917，擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行電泳鑒定，具體PCR引物和反應(yīng)條件采用已建立的方法［16］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，中醫(yī)分型多組的差異比較采用One WAY-ANOVA檢驗(yàn)，進(jìn)一步的多重比較采用LSD法。方差不齊時，選擇近似F檢驗(yàn)Welch法;計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)描述，其差異比較采用χ2檢驗(yàn);所有統(tǒng)計采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性丙型肝炎中醫(yī)證型分布情況，本研究結(jié)果和陳建杰等［14］多中心、大樣本流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)基本一致，見表1。

表1 慢性丙型肝炎中醫(yī)證型分布 例

2.2 慢性丙型肝炎中醫(yī)證型與患者基線情況、肝功能、HCV RNA比較情況 見表2。

2.3 不同證型與NS5A蛋白各區(qū)段aa變異、IL28B SNPs比較情況 見表3。

表2 不同證型的基線情況比較

表3 不同證型的NS5A aa變異和IL28B SNPs比較(±s)

表3 不同證型的NS5A aa變異和IL28B SNPs比較(±s)

證 型 例數(shù) ISDR PKRBD V3 IRRDR NS5A(ISDR-V3)IL28B(TT/TG)正虛邪戀 25 0.88 ±0.73 5.52 ±1.20 4.72 ±1.28 5.80 ±1.50 17.20 ±2.06 18/7脾腎陽虛 5 0.60 ±0.89 5.60 ±0.89 5.00 ±1.00 5.80 ±1.79 17.60 ±2.89 3/2濕熱中阻 9 1.44 ±1.74 6.22 ±2.22 5.22 ±1.09 6.00 ±1.41 18.00 ±3.00 9/0肝郁脾虛 13 0.77 ±0.73 5.46 ±1.33 4.38 ±1.04 5.15 ±1.57 15.46 ±3.36 11/2肝腎陰虛 3 1.00 ±0.00 6.00 ±0.00 5.00 ±0.00 6.00 ±0.00 18.67 ±1.15 3/0瘀血阻絡(luò) 3 1.33 ±0.58 5.67 ±1.16 6.00 ±1.00 6.67 ±1.16 18.00 ±2.65 3/0 F/χ2 0.842 0.434 1.322 0.719 1.549 7.221 P 0.526 0.823 0.269 0.612 0.191 0.205

3 討論

慢性丙型肝炎本虛邪戀型的主要癥狀為乏力、面色無華、小便黃、口干、腹脹等，弦脈、淡紅舌、白苔或膩苔，而慢性丙型肝炎的臨床特點(diǎn)是大多數(shù)患者無明顯臨床癥狀，且血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)正?；蜉p度升高，但是HCV在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制，造成肝組織學(xué)的炎癥損害和纖維化緩慢進(jìn)展［17］。由于這些臨床表現(xiàn)均為非特異性的癥狀和體征，所以常常容易被忽視和漏診。本研究顯示慢性丙型肝炎的中醫(yī)證型中，本虛邪戀型占43.1%，提示應(yīng)該重視對丙型肝炎的臨床篩查和研究。

本研究結(jié)果顯示慢性丙型肝炎中醫(yī)證型與患者年齡和球蛋白有關(guān)。不同中醫(yī)證型組間患者的年齡從小到大依次排列為:肝郁脾虛＜濕熱中阻＜正虛邪戀＜脾腎陽虛＜瘀血阻絡(luò)＜肝腎陰虛，提示肝郁脾虛型多見于年輕患者，瘀血阻絡(luò)型和肝腎陰虛型多見于中老年患者。肝病患者球蛋白水平升高說明HCV感染存在的時間長，累積的肝纖維化程度較重［18］。不同中醫(yī)證型組間患者的球蛋白水平從低到高依次排列為:肝郁脾虛＜正虛邪戀＜肝腎陰虛＜濕熱中阻＜脾腎陽虛＜瘀血阻絡(luò)，提示肝郁脾虛型的肝纖維化較輕，而脾腎陽虛和瘀血阻絡(luò)型肝纖維化較重。

HCV 1b亞型NS5A aa變異以及IL28B SNPs均與以干擾素為基礎(chǔ)的抗病毒治療應(yīng)答效果密切相關(guān)。HCV NS5A位于HCV基因組nt 6258-7601區(qū)域，編碼447個氨基酸，是高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)蛋白，其中ISDR、PKR、V3、IRRDR 和 NS5A(ISDR-V3)區(qū)的氨基酸突變可以影響抗病毒治療的SVR［2-6］。本研究發(fā)現(xiàn)中國陜西地區(qū)HCV 1b亞型CHC患者的NS5A氨基酸突變與中醫(yī)分型無相關(guān)性。2009年，Ge.D等［7］采用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome Wide Association Studie，GWAS)方法，發(fā)現(xiàn)人19號染色體，IL28B上游的SNP位點(diǎn)rs12979860基因型明顯與基因1型抗病毒治療的 SVR 有關(guān)。同年 Suppiah，V［9］和 Tanaka.Y等［10］在nature發(fā)表IL28B另一 SNP位點(diǎn) rs8099917的研究結(jié)果。由于此兩個SNP位點(diǎn)具有很強(qiáng)的連鎖不平衡［16］，所以檢測任一個位點(diǎn)即可。本研究顯示中國陜西地區(qū)IL28B SNP位點(diǎn)rs8099917以TT型為主，占81.03%(47/58)，TG 型占 18.97%(11/58)，未發(fā)現(xiàn)GG型，數(shù)據(jù)與之前對華南地區(qū)的研究一致［16］。但未發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者中醫(yī)分型與NS5Aaa突變和IL28B SNP具有相關(guān)性。

總之，慢性丙型肝炎的中醫(yī)證候客觀量化研究有利于現(xiàn)代中醫(yī)、中西醫(yī)的臨床實(shí)踐和科研創(chuàng)新［19-20］。本研究結(jié)果顯示慢性丙型肝炎中醫(yī)證型中，正虛邪戀型最多，結(jié)合年齡和球蛋白水平分析，肝郁脾虛型多見于年輕患者，且肝纖維化程度較輕，而瘀血阻絡(luò)型和脾腎陽虛型多見于中老年患者，肝纖維化程度較重，而慢性丙型肝炎中醫(yī)證型與HCV RNA、NS5A aa變異以及IL28B SNP無關(guān)，限于例數(shù)較少，這一結(jié)論需要后續(xù)大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。

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