EV71 及CA16 不同檢測方法敏感度及特異性比較

李 華 楊 婷 姜廣菊 何曉娟 岳 磊 謝天宏 楊水芝 朱凡麗 龍潤?quán)l(xiāng) 楊 蓉 羅芳宇 謝忠平

手足口病(hand - foot - and - mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的，為全球性傳染病，多發(fā)生于5 歲以下兒童，尤以＜3 歲兒童發(fā)生率最高［1］?？梢鹗?、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。病毒還可侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等引起腦炎、肺水腫、馳緩性麻痹、心肌炎等癥狀，個別重癥病例還可導(dǎo)致死亡［2～4］。

引起手足口病的腸道病毒有20 多種，其中以柯薩奇病毒A16 型(coxsackievirus A16，C A16)和腸道病毒71 型(enterovirus 71，EV71)最為常見［2］。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會(原衛(wèi)生部)于2008 年5 月2日將HFMD 納入丙類法定傳染病管理，并制訂了相應(yīng)的診療、防控指南［5，6］。2013 年統(tǒng)計手足口病發(fā)病1825649 例，死亡人數(shù)620 例，占丙類傳染病總死亡數(shù)百分比是81.50% 。CA16 和EV71 引起的HFMD臨床表現(xiàn)相似，難以鑒別。而且EV 71 和CA 16 在遺傳學(xué)上同源性也較高，核苷酸序列有77%的同源性，氨基酸序列的同源性為89%［7］。因此，研究快速、準確、特異地對EV 71 和CA 16 的診斷方法尤為重要。目前實驗室檢測手足口病方法，包括病毒分離培養(yǎng)法、血清學(xué)中和試驗法、ELISA 法、病原體核酸RT -PCR 法及熒光定量PCR 法［8～13］。針對目前品種繁多的檢測方法，本試驗通過用不同方法、同種方法的不同試劑，檢測分離的20 株手足口病病毒(CA16、EV71 各10 株)，并進行對比，分析檢測方法及檢測試劑的敏感度及特異性，同時為自制的ELISA 抗原檢測試劑盒找到可參比的試劑和方法。

材料與方法

1.檢測用病毒:選本實驗室從臨床患兒標本中(臨床標本的采集及臨床研究已申請“知情同意書”免簽申請，得到倫理委員會批準)分離、并經(jīng)過鑒定的EV71 病毒株及CA16 毒株各10 株，進行稀釋，選擇原倍、10-3及10-63 個濃度，所有的檢測方法(試劑)均同時對該20 個毒株的不同濃度(稀釋度)病毒進行檢測，以確定其敏感度及特異性。

2.檢測用細胞:Vero 細胞由筆者單位質(zhì)量檢定室提供。

3.EV71 及CA 16 熒光定量PCR 檢測試劑:共選擇市場上銷售量大的5 個試劑公司生產(chǎn)的熒光定量PCR 檢測試劑盒，分別編號為A 公司、B 公司、C 公司、D 公司及E 公司。實驗的操作及結(jié)果的判定均嚴格按各試劑的使用說明書進行操作。

4.RT-PCR 檢測方法:按表1 設(shè)計VP1 引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成［14］;采用核酸提取試劑盒(硅膠膜吸附法)提取病毒核酸，用Prime Script One Step RT-PCR Kit(TaKaRa 公司，大連)對VP1 片段進行擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 EV71 及CA16 RT-PCR 引物設(shè)計序列

5.EV71 及CA16 ELISA 抗原檢測試劑:由筆者所在研究室制備［8，9］。

6.細胞培養(yǎng)法:將不同稀釋度的病毒接種Vero 細胞，37℃培養(yǎng)7 天觀察細胞病變情況，以出現(xiàn)病變的最高稀釋度為檢測敏感度。

結(jié) 果

1.EV71 及CA16 不同檢測方法的敏感度:經(jīng)過對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，其檢測方法的敏感度依次為:熒光定量PCR 檢測方法、細胞培養(yǎng)病變法(中和法)、普通RT-PCR(VP1)及ELISA 抗原檢測法。對于病毒含量達到106CCID50/ml 的樣品，所有檢測方法的檢出率均可達100%;對于病毒含量達到103CCID50/ml 的樣品，細胞培養(yǎng)法檢出率達100%，熒光定量PCR 檢測試劑檢出率為80% ～100%，普通RT-PCR(VP1)檢測率約50%，而ELISA 抗原檢測試劑檢出率僅為10%;對于＜20 CCID50/ml 病毒載量的樣品，則僅有熒光定量PCR 可檢出，檢出率為0 ～50%(表2、表3)。

2.EV71 及CA16 不同檢測試劑的敏感度:CA16檢測試劑，對于病毒量達到106CCID50/ml 樣品，所用5 個生產(chǎn)廠家的熒光定量PCR 檢測試劑均能100%檢出;對于病毒量達到103CCID50/ml 級樣品，熒光定量PCR 檢測試劑檢出率為80% ～100%，對于＜20CCID50/ml 病毒量的樣品，則只有熒光定量PCR 檢測試劑才可檢出。熒光定量PCR 檢測EV71 的敏感度順序為D ＞B ＞A=E=C;熒光定量PCR 檢測CA16 的敏感度順序為C ＞E ＞D ＞B ＞A (表4、表5)。

3. 檢測方法的特異性:經(jīng)檢測ELISA 抗原檢測試劑、細胞培養(yǎng)病變法(中和法)及普通RT - PCR(VP1)3 種方法均未發(fā)現(xiàn)非特異性假陽性結(jié)果，表現(xiàn)為檢測方法特異性好，而所用的5 個生產(chǎn)廠家的熒光定量PCR 檢測試劑均出現(xiàn)不同程度的非特異性假陽性結(jié)果，即熒光定量PCR 檢測方法特異性差(表2、表3)。

4.檢測試劑的特異性:5 個生產(chǎn)廠家的熒光定量PCR 檢測試劑均出現(xiàn)不同程度的非特異性假陽性結(jié)果，假陽性率為10% ～100%;通過對5 家EV71 熒光定量檢測試劑的特異性進行分析，其順序為D ＞A ＞E ＞C ＞B;檢測CA16 的特異性順序為A ＞C ＞D ＞E ＞B，呈現(xiàn)出假陽性率為高病毒量的樣品假陽性率高，低病毒量的樣品假陽性率低的趨勢(表4、表5)。

表2 EV71 4 種檢測方法敏感度及特異性分析

表3 CA16 4 種檢測方法敏感度及特異性分析

表4 EV71 檢測試劑敏感度及特異性分析

表5 CA16 檢測試劑敏感度及特異性分析

5. EV71 及CA16 熒光定量PCR 檢測試劑假陽性結(jié)果分析:通過對產(chǎn)生假陽性樣品的CT 值進行分析，除C 公司EV71 試劑檢測CA16 樣品CT 值集中在20 ～30 外，其余均集中在＞30 的區(qū)域，接近陽性標準的上限值，應(yīng)該是在灰區(qū)的范圍(表6)，所以確定可疑值范圍或設(shè)定灰區(qū)是有必要的。從研究的結(jié)果分析，凡CT 值在灰區(qū)范圍內(nèi)的樣品都應(yīng)按要求進行重試，這樣可以減少非特異陽性結(jié)果的產(chǎn)生，保證檢測結(jié)果的可靠性和準確性。

表6 EV71 及CA16 熒光定量PCR 檢測試劑假陽性結(jié)果CT 值分析

討 論

對手足口病主要病原體EV71 及CA16 的檢測，最初采用病毒培養(yǎng)的方法，但病毒培養(yǎng)方法耗時長，不能滿足臨床上早期診斷和治療的要求。隨后建立了ELISA 方法，加快了EV71 及CA16 病毒的檢測速度。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，RT -PCR 及熒光定量PCR 技術(shù)獲得廣泛應(yīng)用。

從檢測樣品的分析結(jié)果顯示，熒光定量PCR 檢測法、細胞培養(yǎng)病變法(中和法)、普通RT - PCR(VP1)及ELISA 抗原4 種檢測方法，熒光定量PCR檢測方法敏感度最高，且可檢測到＜20CCID50/ml 病毒載量的樣品，這與報道一致，熒光定量PCR 檢測方法最低檢測限達到9.22 ×102PFU/ml 的樣本，敏感度比RT-PCR 方法高10 倍［15，16］。但熒光定量PCR檢測法也有不足，即特異性差，易造成誤差，出現(xiàn)假陽性。對于病毒量達到103CCID50/ml 級樣品，細胞培養(yǎng)法能100%檢出、熒光定量PCR 檢測試劑檢出率為80% ～100%不等、普通RT -PCR(VP1)檢測率約為50%，而ELISA 抗原檢測試劑檢出率僅為10%左右，由此試驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)法檢出率高，是可以與熒光定量PCR 相提并論的，只是由于細胞培養(yǎng)法耗時長，對實驗室條件及操作人員要求嚴格，且一般縣級單位不具備細胞培養(yǎng)的硬件設(shè)施條件和要求，所以選擇熒光定量PCR 或者普通RT -PCR 進行病毒檢測。

特異性的檢測可以看出所用5 個生產(chǎn)廠家的熒光定量PCR 檢測試劑均出現(xiàn)不同程度的非特異性假陽性結(jié)果，假陽性率出現(xiàn)的趨勢是高病毒量的樣品假陽性率高，低病毒量的樣品假陽性率低，且假陽性率從10%至100%不等，這與報道不相符［17～19］。這可能是由于本次所用的樣品為細胞培養(yǎng)的病毒液，病毒含量相對于臨床采集樣品具有病毒載量高的原因所致。EV71 及CA16 熒光定量PCR 檢測的結(jié)果是根據(jù)CT 值進行判定的，所以CT 值大于試劑盒陽性判定標準值為陰性，反之為陽性，在灰區(qū)為可疑值，應(yīng)進行重試。在本實驗中，EV71 試劑檢測CA16 樣品有50.0%(15/30)在可疑值范圍內(nèi)、CA16 試劑檢測EV71 樣品有53.6%(15/28)在可疑值范圍內(nèi)，在此這些樣品應(yīng)按說明書要求進行重試2 次，這樣可以減少非特異陽性結(jié)果的產(chǎn)生，有必要的還進行敏感細胞的分離培養(yǎng)，降低假陽性的發(fā)生率。有研究結(jié)果顯示，RT -PCR 法與RD 細胞病毒分離法檢測出的陽性標本按不同分類統(tǒng)計比較后，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［20］。從本試驗結(jié)果看，細胞培養(yǎng)病變法(中和法)及普通RT-PCR(VP1)法檢測出的陽性標本按不同分類統(tǒng)計比較后，兩者差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，這與報道一致。

綜上所述，分析比較5 個生產(chǎn)廠家檢測試劑的敏感度及特異性，可以得出檢測EV71 和CA16 分別選擇D、C 廠家的熒光定量PCR 試劑效果較好。4 種檢測方法中，雖然細胞培養(yǎng)病毒分離是確定手足口病病原體的金標準，但所需時間相對較長，本試驗結(jié)果顯示細胞培養(yǎng)病變法及普通RT -PCR(VP1)法檢測的結(jié)果一致性高，所以在應(yīng)急階段可首選普通RT -PCR(VP1)法。

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