叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立

楊玉霞 劉 杏 黃晶晶 鐘毅敏 肖 輝

氧化應(yīng)激的概念源自人類對(duì)衰老的研究。1956年，Harman［1］將衰老和氧化聯(lián)系起來，提出了衰老的自由基學(xué)說。他認(rèn)為自由基(free radical)包括O2-及其衍生物通過攻擊生物高分子對(duì)組織細(xì)胞造成的損傷是導(dǎo)致衰老的原因，也是導(dǎo)致多種疾病的重要因素。1990 年，Sohal 等［2］提出的氧化應(yīng)激概念，補(bǔ)充和發(fā)展了自由基學(xué)說，認(rèn)為機(jī)體細(xì)胞存在著氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡，年輕的細(xì)胞維持著氧化和抗氧化的平衡，但是如果氧化應(yīng)激過多，細(xì)胞則需要更多的能量來清除自由基，而細(xì)胞可利用的能量是有限的，當(dāng)自由基超出了細(xì)胞抗氧化的能力時(shí)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷便發(fā)生了。Bunin［3］研究發(fā)現(xiàn)青光眼患者眼內(nèi)抗氧化屏障功能減退，包括房水中抗壞血酸濃度降低，POAG 小梁組織內(nèi)GST 含量降低，其幅度與病程相關(guān)。青光眼患者房水內(nèi)總抗氧化還原電位(TRAP)較白內(nèi)障患者減少64%，且與SOD 和GST過氧化物酶活性增加相關(guān)［3，4］。Izzotti 等［5］認(rèn)為，氧化損傷正是原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機(jī)制中“青光眼鏈”的開始。為了進(jìn)一步研究小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制，筆者建立小梁細(xì)胞(immortalized human trabecular meshwork cells，iHTM)的叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)氧化刺激模型，并觀察氧化應(yīng)激后小梁細(xì)胞活性、細(xì)胞活性氧、蛋白酶體復(fù)合物活性以及細(xì)胞凋亡的變化情況。

材料與方法

1.試劑:正常人小梁細(xì)胞系iHTM 為加拿大魁北克Laboratory of Ocular Genetics and Genomics 的Vincent Raymond 教授所贈(zèng)。DMEM/F12 培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)均購自Gibco 公司。噻唑藍(lán)(3，24，5 dimethyliazol 22，5 diphenyl tetrazolium bromide，MTT)、Hochest33258、tBHP 購自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，多聚甲醛購自北京化工廠，活性氧檢測(cè)試劑盒購自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，蛋白酶體復(fù)合物檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Promega 公司，Annexin-Ⅴ/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)BioVision 公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為美國(guó)BioTek 公司，激光共聚焦熒光顯微鏡為德國(guó)Zeiss 公司(LSM 510 Meta 型)。美國(guó)BD 公司FACSAria 型流式細(xì)胞儀和BD FACSiva software 數(shù)據(jù)分析軟件。

2.實(shí)驗(yàn)分組:陰性對(duì)照組(control)為正常培養(yǎng)的細(xì)胞，不用tBHP 進(jìn)行處理。tBHP 處理1h 組(tBHP1h):為含200μmol/L tBHP 的DMEM 工作液培養(yǎng)1h。tBHP 處理2h 組(tBHP2h):為含200μmol/L tBHP 的DMEM 工作液培養(yǎng)2h。

3.MTT 法檢測(cè)tBHP 刺激后小梁細(xì)胞的活性:將細(xì)胞按上述方法分別處理后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1 ×105/ml，取80μl 加入96 孔板中，加入培養(yǎng)液至180μl，再加入MTT 液20μl，，每一處理?xiàng)l件設(shè)6 個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(只加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。繼續(xù)培養(yǎng)4h 后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200μl，充分混勻，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定每孔的吸光度(A 值)，波長(zhǎng)為490nm，以反映活細(xì)胞的數(shù)目。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)tBHP 刺激后小梁細(xì)胞活性氧水平:將iHTM 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1ml 終濃度為10μmol/L 的DCFH-DA。將細(xì)胞置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH -DA。按前面所述，加入tBHP 工作液，待培養(yǎng)1h 和2h 后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

5.Suc-LLVY-GloTM substrate 檢測(cè)tBHP 刺激后小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物的活性:將iHTM 細(xì)胞以5 ×104/ml 的密度接種在96 孔的白板中，每孔200μl。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，使用tBHP 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，如前所述。使用美國(guó)Promega 公司的Chymotrypsin-like Cell-Based Assays 檢測(cè)糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物的活性。操作步驟依試劑盒說明進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(RLU)，RLU 的高低反映了糜蛋白酶樣蛋白酶體活性的強(qiáng)弱。

6.Hoechst33258 檢測(cè)tBHP 刺激后小梁細(xì)胞的凋亡:將細(xì)胞按上述方法分別處理后，收集細(xì)胞，PBS 洗滌，吹散，用微量加樣槍滴片，風(fēng)干，甲醇固定。水洗3min，用Hoechst 33258 染色5min，晾干，甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察。

7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)tBHP 刺激后小梁細(xì)胞的凋亡:將細(xì)胞按上述方法分別處理后，收集細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量≥1 ×109個(gè)/升)。取1ml 細(xì)胞懸液按Annexin-Ⅴ/PI 雙染試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。1h 內(nèi)使用流式細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行定量檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:本研究所涉及的組間之間的比較均采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析(one - way ANOVA)進(jìn)行組間比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.tBHP 刺激后小梁細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變:正常培養(yǎng)的小梁細(xì)胞呈梭形，折光性好，貼壁良好;tBHP 處理1h 后，部分細(xì)胞變圓、脫落、皺縮;tBHP 處理2h后，大部分細(xì)胞變圓、皺縮、懸浮于培養(yǎng)液中(圖1)。

圖1 經(jīng)tBHP 處理后小梁細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×100)

2.tBHP 刺激后小梁細(xì)胞活性的改變:設(shè)對(duì)照組細(xì)胞活性為100%，則tBHP1h 組細(xì)胞活性為69.3% ±1.5%;tBHP2h 組細(xì)胞活性為57.9% ±2.2%(表1)。經(jīng)one-way ANOVA 分析，3 組間細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=602.327，P =0.000)。進(jìn)一步對(duì)各組間的細(xì)胞活性進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果為對(duì)照組與tBHP1h 組和tBHP2h 組比較、tBHP1h 組與tBHP2h 組比較，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均=0.000)。

表1 tBHP 刺激后小梁細(xì)胞的改變(±s)

表1 tBHP 刺激后小梁細(xì)胞的改變(±s)

組別 細(xì)胞活性(%) 活性氧水平 凋亡率(%)蛋白酶體活性(%)100 1 3.0% ±1.8 100 tBHP1h 69.3 ±1.5 53.5 ±1.8 28.23 ±3.2 70.6 ±0.9 tBHP2h 57.9 ±2.2 121.8 ±4.2 39.2 ±5.9 74.9 ±0.5 F對(duì)照組602.3 528.4 67.8 783.5 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3.tBHP 刺激后小梁細(xì)胞活性氧的改變:將對(duì)照組ROS 水平設(shè)為1，則tBHP1h 組ROS 水平為對(duì)照組的53.5 ±1. 8 倍;tBHP2h 組ROS 水平為對(duì)照組的121.8 ±4.2 倍(表1)。將對(duì)照組ROS 水平設(shè)為1，則tBHP1h 組ROS 水平為對(duì)照組的53.47 ±1.75 倍;tBHP2h 組ROS 水平為對(duì)照組的121. 81 ±4. 2 倍;經(jīng)one-way ANOVA 分析，3 組間細(xì)胞ROS 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =528.366，P =0.000)。進(jìn)一步對(duì)各組間的ROS 水平進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果為對(duì)照組與tBHP1h 組和tBHP2h 組比較、tBHP1h 組與tBHP2h 組比較，P 均=0.000，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.tBHP 刺激后小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性的改變:將對(duì)照組小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性的熒光強(qiáng)度設(shè)為100%，則tBHP1h組小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性較對(duì)照組下降70.6% ±0.9%;tBHP2h 組小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性較對(duì)照組下降74. 9% ±0.5%(表1)。將對(duì)照組小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性的熒光強(qiáng)度設(shè)為100%，則tBHP1h 組小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性較對(duì)照組下降70.59% ±0.88%;tBHP2h 組小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性較對(duì)照組下降74. 93% ±0.54%，對(duì)3 組間的小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性進(jìn)行one -way ANOVA 分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=783.469，P =0.000)。進(jìn)一步對(duì)各組的小梁細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復(fù)合物活性進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果為對(duì)照組與tBHP1h 組和tBHP2h 組比較，P均=0.000;tBHP1h 組與tBHP2h 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043)。

5.Hoechst33258 染色觀察tBHP 刺激后小梁細(xì)胞凋亡:激光共聚焦熒光顯微鏡觀察正常培養(yǎng)的小梁細(xì)胞，細(xì)胞核Hoechst33258 染色呈較均勻的藍(lán)色，凋亡細(xì)胞少見。經(jīng)過tBHP 處理1h，部分小梁細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞核變小，Hoechst33258 染色呈亮白色;經(jīng)tBHP 處理2h，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖2)。

圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)tBHP 刺激前后小梁細(xì)胞的凋亡

6. 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)tBHP 刺激后小梁細(xì)胞的凋亡比例:經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)，在正常對(duì)照組iHTM 細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞比例為3.0% ±1.8%。tBHP 1h 組凋亡細(xì)胞比例為28.23% ±3.20%，凋亡以晚期凋亡為主;tBHP 處理2h 組凋亡細(xì)胞比例為39.2% ±5.9%，且凋亡細(xì)胞以晚期凋亡和細(xì)胞壞死為主;凋亡細(xì)胞比例比對(duì)照組和tBHP1h 組明顯增加(圖3、表1)。將3 組間細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行one - way ANOVA分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =67.784，P =0.000)。進(jìn)一步將各組間的細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行兩兩分析，結(jié)果分別是對(duì)照組與tBHP1h 組和tBHP2h 比較，P 均=0.000;tBHP1h 組與tBHP2h 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。

圖3 tBHP 刺激后小梁細(xì)胞凋亡的變化

討 論

1.氧化損傷對(duì)小梁細(xì)胞形態(tài)改變的影響:已有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是POAG 疾病發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素。Sacca 等［6］報(bào)道氧化應(yīng)激可能通過損傷小梁網(wǎng)，而導(dǎo)致眼壓升高和青光眼視神經(jīng)損害的進(jìn)展。在Izzotti 等［7］的一項(xiàng)病例對(duì)照研究中，他們檢測(cè)了包括了79 名POAG 患者和156 名正常對(duì)照者的線粒體DNA 損傷情況，發(fā)現(xiàn)氧化損傷在青光眼患者線粒體損傷以及啟動(dòng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞丟失方面起了重要作用。Liu 等［8］報(bào)道在小鼠的急性高眼壓模型中，眼壓升高后數(shù)小時(shí)內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞即發(fā)生氧化損傷，說明氧化損傷在青光眼視神經(jīng)病變?cè)缙诩串a(chǎn)生了影響。周琦等［9］報(bào)道氧化損傷可以使豬小梁細(xì)胞黏附因子ICAM-1 下降以及Luna 等［10］發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以使小梁細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)增加，基質(zhì)蛋白酶含量下降。筆者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的人小梁細(xì)胞經(jīng)tBHP 刺激后，細(xì)胞變圓、收縮，由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài)，并且隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性變的越來越差。

2.氧化損傷對(duì)小梁細(xì)胞活性的影響:體外誘導(dǎo)小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激可使其發(fā)生類似POAG 的改變，如細(xì)胞外基質(zhì)堆積、細(xì)胞溶解死亡、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂、脂褐素增加等，如果用抗氧化劑和降眼壓藥物預(yù)處理則可減輕這種改變［5］。持續(xù)的ROS 可破壞線粒體膜電位，最終導(dǎo)致小梁網(wǎng)損傷，房水流出受阻。對(duì)POAG 患者的研究發(fā)現(xiàn)，ROS 引起的小梁細(xì)胞DNA 的損傷與眼壓的升高和視野的喪失顯著相關(guān)。在小梁網(wǎng)氧化應(yīng)激過程中，持續(xù)的活性氧刺激使負(fù)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular cell matrix，ECM)相關(guān)基因表達(dá)降低，從而促進(jìn)了小梁網(wǎng)處ECM 沉積，房水流出受阻。筆者用tBHP 作為氧化應(yīng)激的刺激源，對(duì)培養(yǎng)的小梁細(xì)胞進(jìn)行刺激，作用1h 后細(xì)胞活性下降30.70% ±1.50%，刺激2h 后，細(xì)胞活性進(jìn)一步下降(42.12% ±2.20%)，說明氧化應(yīng)激損傷具有時(shí)間依賴性，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，tBHP 對(duì)細(xì)胞造成的損傷加重?；钚匝?ROS)是指化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子或原子團(tuán)，超氧自由基(O-2)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等?；钚匝跏羌?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必需的物質(zhì)，但是過量的活性氧也會(huì)損傷線粒體、蛋白質(zhì)以及核酸，對(duì)細(xì)胞造成損傷。筆者發(fā)現(xiàn)tBHP 刺激小梁細(xì)胞后可使細(xì)胞的活性氧增加，刺激1h 后增加53.47 ±1.75 倍，刺激2h 后增加121.81 ±4.20 倍，同樣隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性氧水平增加。如前所述，小梁細(xì)胞經(jīng)tBHP 處理后可發(fā)生細(xì)胞變圓、收縮、由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài)，細(xì)胞活性也顯著下降，這些可能都與ROS 的增加有關(guān)。

3.氧化損傷對(duì)小梁細(xì)胞蛋白酶體復(fù)合物活性的影響:蛋白酶體是相對(duì)分子質(zhì)量為700kDa 的復(fù)合體，包含糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣、天冬氨酸特異性蛋白水解酶樣3 種蛋白酶活性。蛋白酶體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要途徑，也是清除細(xì)胞內(nèi)變性受損蛋白質(zhì)的主要工具，它的活性反映了細(xì)胞對(duì)抗損傷的能力。泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能的降低可影響眼科的多種疾病如視網(wǎng)膜色素病變，黃斑變性，青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變等［11］。Guo 等［12］發(fā)現(xiàn)在晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和分化過程均需要蛋白酶體的參與。張鐵英等［13］研究發(fā)現(xiàn)與透明晶狀體相比，白內(nèi)障晶狀體上皮內(nèi)蛋白酶體的糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣酶活性明顯降低，并認(rèn)為蛋白酶體活性降低可能在老年性白內(nèi)障的形成中起重要的調(diào)節(jié)作用。Zhang 等［14］報(bào)道40 ～50mmol/L 的H2O2可引起體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中蛋白酶體活性的明顯下降。Caballero等［15］報(bào)道將人小梁細(xì)胞培養(yǎng)于40%O2環(huán)境中，可以引起小梁細(xì)胞蛋白酶體活性的降低。筆者使用能被糜蛋白酶樣水解酶的底物Suc -Leu -Leu -Val-Tyr-AMC (LLVY)來檢測(cè)糜蛋白酶樣蛋白酶的活性，結(jié)果表明培養(yǎng)的人小梁細(xì)胞經(jīng)tBHP 刺激后1h 后，細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體的活性下降70. 59% ±0.88%，刺激2h 后進(jìn)一步下降(74.93% ±0.54%)。在氧化應(yīng)激后，蛋白酶體復(fù)合物活性下降，一方面可能是因?yàn)榈鞍酌阁w復(fù)合物結(jié)合了大量受氧化損傷的蛋白質(zhì)，造成的蛋白酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)飽和;另一方面可能是由于tBHP 直接造成了蛋白酶體復(fù)合物的氧化損害，導(dǎo)致了蛋白酶體復(fù)合物功能的下降。蛋白酶體復(fù)合物功能下降，細(xì)胞內(nèi)受損蛋白無法及時(shí)被降解，可以加劇氧化應(yīng)激對(duì)小梁網(wǎng)的損傷。

4.氧化損傷對(duì)小梁細(xì)胞凋亡的影響:凋亡不同于壞死，壞死是由損傷因子引起的被動(dòng)死亡，因?yàn)閴乃赖募?xì)胞常常要釋放出內(nèi)含物，所以一般會(huì)引起炎癥。而凋亡是細(xì)胞的程序化死亡過程，是能量依賴的主動(dòng)的死亡過程，由凋亡通路引起，不產(chǎn)生炎性反應(yīng)。在青光眼患者，不論視網(wǎng)膜還是眼前段小梁網(wǎng)組織都存在較高的氧化應(yīng)激水平［16］。POAG 患者的小梁網(wǎng)組織存在著諸多形態(tài)學(xué)和生物學(xué)的異常，如細(xì)胞丟失較多，細(xì)胞骨架的改變，細(xì)胞老化現(xiàn)象以及亞臨床炎癥的表現(xiàn)。目前認(rèn)為持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了這些改變［17］。筆者通過tBHP 氧化刺激體外培養(yǎng)的小梁細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)tBHP 刺激1h 后，凋亡細(xì)胞比例為28.23% ±3.23%，刺激2h 后，凋亡細(xì)胞比例為39. 20% ±5.91%，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞增加明顯;說明小梁細(xì)胞的氧化應(yīng)激加劇了細(xì)胞的凋亡，從而造成小梁網(wǎng)功能損傷。

筆者的研究表明，小梁細(xì)胞經(jīng)tBHP 刺激后，細(xì)胞ROS 水平增加，細(xì)胞凋亡比例增加，細(xì)胞蛋白酶體復(fù)合物的活性降低，小梁細(xì)胞活性降低，上述改變與刺激時(shí)間相關(guān)，隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，上述改變更加顯著。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)tBHP 直接造成的細(xì)胞壞死并不多，說明tBHP 可用于小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型建立，并且是一種易于誘導(dǎo)小梁細(xì)胞凋亡的氧化劑。

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