超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法分析不同炮制紅參的化學(xué)成分差異

鐘 薇，戴雨霖，李曉宇，王一博，越 皓，劉淑瑩,2

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130022)

人參屬傘形目、五加科植物人參PanaxginsengC. A. Meyer的干燥根。紅參是鮮人參的熟用品，加工過(guò)程中因發(fā)生熱解和水解反應(yīng)，人參皂苷的種類和含量發(fā)生了變化，藥理作用也隨之發(fā)生改變[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參中皂苷類化合物是主要的活性成分，對(duì)增強(qiáng)人體免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、抗高血壓、抗糖尿病、抗癌等有很好的作用[4-5]。人參皂苷屬三萜類化合物，按皂苷元結(jié)構(gòu)的不同可分為原人參二醇型皂苷(Protopanaxadiol,PPD)、原人參三醇型皂苷(Protopanaxatriol,PPT)和齊墩果烷型人參皂苷(Oleanolic acid)3類。人參被批準(zhǔn)為人參新資源食品后，呈現(xiàn)了適用人群擴(kuò)大、方式多樣化的特點(diǎn)。紅參因炮制方法的不同，成分差異很大，蒸制紅參是在高溫條件下通過(guò)水蒸氣蒸制的；醋制紅參是在溫度、pH值酸性和水共同作用下獲得的；而烘干紅參是在高溫條件下炮制得到的。除紅參的傳統(tǒng)加工品外，醋制紅參和烘干紅參是新開發(fā)的人參產(chǎn)品，其藥效功能和化學(xué)成分不同于傳統(tǒng)的生曬參和紅參[6-8]。

本研究擬采用四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜分析高溫烘干紅參、蒸制紅參和醋制紅參的化學(xué)成分差異及含量，旨為更好地發(fā)揮人參不同炮制品的作用和指導(dǎo)臨床工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)、Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀：美國(guó)Thermo-Fisher公司產(chǎn)品。人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2對(duì)照品(純度均大于98%)：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 紅參的炮制

蒸制紅參的制備：取鮮參，在100 ℃蒸參柜中蒸制4 h，于50 ℃鼓風(fēng)烘箱中烘干。

醋制紅參的制備：取鮮參，在陳醋中浸泡30 min，向100 ℃蒸參柜中加入陳醋蒸制4 h，于50 ℃鼓風(fēng)烘箱中烘干。

高溫烘干紅參：取鮮參，在105 ℃鼓風(fēng)烘箱中高溫快速烘干。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取1 g紅參粉末，加入20 mL甲醇超聲提取30 min，蒸干濾液，再經(jīng)乙醚脫脂，飽和正丁醇萃取，蒸干后加甲醇溶解，并定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 C18毛細(xì)管柱(100 mm×3 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～3 min、25%～30%A，3～6 min、30%～32%A，6～7 min、32%～35%A，7～13 min、35%～37%A，13～19 min、37%～48%A，19～22 min、48%～70%A，22～25 min、70%～90%A，30 min、25%A；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 負(fù)離子掃描方式，霧化溫度300 ℃，霧化氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 400。

2 結(jié)果與分析

靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)量分析器的質(zhì)量精度誤差小于1×10-6，全掃描模式自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜，能夠在不因離子數(shù)目增加而損失靈敏度的前提下進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析，從而發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物不同炮制品化學(xué)成分的差異[9-10]。紅參的3種不同炮制品的色譜圖示于圖1。

人參皂苷Rd、Re的理論值均為946.550 1，元素組成相同，且二者在一級(jí)質(zhì)譜圖中均產(chǎn)生[M+HCOOH-H]-離子(理論值m/z991.548 3)，所以很難區(qū)分。人參皂苷Rd為二醇型人參皂苷，而人參皂苷Re為三醇型人參皂苷，在負(fù)離子模式下，它們的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。人參皂苷Rd丟失1～3分子中性葡萄糖殘基(162 u)，得到m/z783、621、459碎片離子，其中m/z459離子為二醇型人參皂苷的特征碎片離子，示于圖2a；而人參皂苷Re可連續(xù)脫去一分子甲酸得到m/z945碎片離子、一分子鼠李糖殘基(146 u)得到m/z799碎片離子、兩分子葡萄糖殘基(162 u)得到m/z637、475碎片離子，其中m/z475為三醇型人參皂苷的特征碎片離子，示于圖2b。

圖1 負(fù)離子模式下，蒸制紅參(a)、醋制紅參(b)和烘干紅參(c)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of red ginseng processed by steaming (a), vinegar (b) and drying (c) in negative ion mode

圖2 負(fù)離子模式下，人參皂苷Rd(a)和人參皂苷Re(b)的MS/MS譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of ginsenoside Rd (a) and ginsenoside Re (b) in negative ion mode

丙二?；藚⒃碥誖b1(mRb1)為二醇型人參皂苷，其C-3位取代基團(tuán)為一分子丙二酰基和兩分子葡萄糖所形成的側(cè)鏈。丙二酰基人參皂苷mRb1的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖3，從中可觀察到m/z1 107、945、783、621、459等碎片離子。其中，m/z1 107[M-malonyl-H]-為m/z1 193離子脫去丙二?；?86 u)產(chǎn)生的特征碎片離子；m/z1 193脫去丙二?；退纬闪薽/z1 089離子；脫去1～4分子葡萄糖殘基和水分子分別產(chǎn)生了m/z945、783、621、459等碎片離子。人參皂苷mRb1存在于鮮人參和生曬參中，易受熱分解，在醋制紅參中能夠發(fā)現(xiàn)，但在蒸制紅參和高溫烘干紅參中未檢出。

圖3 負(fù)離子模式下，人參皂苷mRb1的MS/MS譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of ginsenoside mRb1 in negative ion mode

人參皂苷Rg1和Rf的分子質(zhì)量均為800.492 2，但根據(jù)保留時(shí)間的不同，能夠很好的進(jìn)行區(qū)分，其色譜圖示于圖4a。人參皂苷Rg1和Rf的二級(jí)質(zhì)譜圖分別示于圖4b和4c，二圖中均可看到m/z637和m/z475碎片離子，但同樣的電離能碎片豐度比不同。經(jīng)方法重現(xiàn)性考察，人參皂苷Rg1子離子m/z475與母離子的比例大于人參皂苷Rf子離子m/z475與母離子的比例。人參皂苷Rg1分別在C6位和C20位連接一分子葡萄糖基，人參皂苷Rf在C6位連接兩分子葡萄糖基。研究表明，在串聯(lián)質(zhì)譜中，C20位失去葡萄糖基所需的能量更低，從而更容易將其失去。

通過(guò)保留時(shí)間、MS/MS碎片離子、精確質(zhì)量等信息與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11-16]信息比較，對(duì)蒸制紅參、醋制紅參及高溫烘干紅參進(jìn)行鑒定，其結(jié)果附于文后表中。

圖4 負(fù)離子模式下，人參皂苷Rg1和Rf的色譜圖(a)，人參皂苷Rg1(b)和Rf(c)的MS/MS譜圖Fig.4 Chromatogram of ginsenoside Rg1 and Rf (a), MS/MS spectrum of ginsenoside Rg1 (b) and Rf (c) in negative ion mode

3 結(jié)論

本研究在蒸制紅參、醋制紅參和烘干紅參中分別鑒定出24、25和24個(gè)人參皂苷。其中，人參皂苷mRb1、Rh1、F1、20(R)-Rh1、Rg5和Rs5僅在醋制紅參中檢出，notoR1僅在蒸制紅參中檢出。酸性條件對(duì)丙二酰人參皂苷有穩(wěn)定作用，同時(shí)對(duì)于稀有人參皂苷的生成也有促進(jìn)作用。

本研究共發(fā)現(xiàn)11組同分異構(gòu)體，在人參皂苷的串聯(lián)質(zhì)譜中，C20位取代基比C6位取代基更容易失去葡萄糖基，這可作為區(qū)分同分異構(gòu)體的參考。

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