葛根素保護(hù)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚

吳青青 唐其柱

心肌肥厚是心臟在遭受各種刺激，如機(jī)械刺激(高血壓、瓣膜狹窄)和神經(jīng)體液刺激(血管緊張素2、內(nèi)皮素-1、腎上腺素等)引起的心臟適應(yīng)性反應(yīng)，其主要特征包括心肌細(xì)胞肥大、蛋白質(zhì)合成增多、胚胎基因的激活［1，2］。早期心肌肥厚可代償心臟對(duì)各種刺激的反應(yīng)，然而持續(xù)的心肌肥厚最終會(huì)使心臟走向失代償，引發(fā)心力衰竭［3，4］。因此心肌肥厚的防治對(duì)降低心力衰竭發(fā)生、發(fā)展尤為重要，然而目前臨床上仍無(wú)藥物能有效預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，因此尋找防治心肌肥厚的新靶點(diǎn)和新藥物刻不容緩。

葛根素為葛根的主要活性成分。在中國(guó)古代醫(yī)學(xué)中葛根被廣泛用于治療發(fā)熱、急性痢疾、腹瀉、糖尿病和心血管疾病等［5］。近年來(lái)，多數(shù)研究表明葛根素可以抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌［6］。此外葛根素還具有抗細(xì)胞凋亡以及抗氧化作用［7，8］。在心臟中的研究表明葛根素促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的T 管的發(fā)育，葛根素通過(guò)調(diào)節(jié)P2X3 受體能減輕大鼠心肌缺血誘導(dǎo)的大鼠頸上神經(jīng)節(jié)交感興奮的反應(yīng)［9，10］。葛根素通過(guò)降低心肌TGF-β1 的表達(dá)抑制異丙腎上腺素引起的小鼠心肌纖維化［11］。上述研究均表明葛根素在心臟中發(fā)揮著重要作用，然而其在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用尚不明確。本研究采用胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)(aortic banding，AB)建立小鼠心肌肥厚模型，探討葛根素在心肌肥厚中的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性C57/BL6 小鼠購(gòu)買于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

2.實(shí)驗(yàn)分組:①假手術(shù)組(n=7);②AB 手術(shù)組(n =12);③葛根素+AB 組(n =12)。其中③組于手術(shù)1 周后開(kāi)始給藥，藥物根據(jù)小鼠飲食量加至小鼠食物中保證每日給藥量為65mg/(kg·d)，連續(xù)喂至術(shù)后12 周，取心臟。

3.胸主動(dòng)脈縮窄術(shù):用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉小鼠，備皮，氣管插管后用呼吸機(jī)輔助呼吸。小鼠右側(cè)臥位，固定好雙上肢和下肢，用碘酒及75%乙醇對(duì)手術(shù)區(qū)皮膚進(jìn)行清潔消毒。在第2、3 肋間開(kāi)胸，用擴(kuò)胸器撐開(kāi)胸腔，用細(xì)棉簽向右下?lián)荛_(kāi)左肺，顯微剪剪開(kāi)縱隔，鈍性無(wú)齒直鑷和彎鑷游離出主動(dòng)脈弓降支，并將7 -0 結(jié)扎線穿過(guò)血管，在血管上方平行放置1 個(gè)26G/27G 注射器針頭，將血管及針頭一起結(jié)扎，迅速抽出針頭即可達(dá)到血管縮窄，關(guān)胸。假手術(shù)組只掛線不結(jié)扎，術(shù)后護(hù)理1 周，以后每天觀察記錄小鼠死亡情況。

4.心臟取材:稱量小鼠體重記錄后采用頸椎脫臼處死法迅速處死小鼠。將處死的小鼠放在鋪有手術(shù)治療巾的手術(shù)臺(tái)上，用浸透雙蒸水的紗布?jí)K濕潤(rùn)胸腹部毛發(fā)，用眼科鑷夾住小鼠劍突處皮膚，用手術(shù)剪沿胸骨正中向頭剪開(kāi)皮膚，再提起劍突剪開(kāi)橫隔，剪去胸骨和左右肋骨充分暴露心臟和雙肺;用眼科彎鑷夾住兩心耳下方血管蒂剪下小鼠心臟后放入10%KCl 溶液中讓心臟在舒張期停跳，輕輕擠出心腔內(nèi)的液體，修剪心臟，稱重記錄，將心臟置于10%甲醛溶液中固定。取出小鼠肺重稱重記錄。將小鼠右下肢脛骨皮膚剪開(kāi)，測(cè)量脛骨長(zhǎng)度。

5.病理染色:經(jīng)甲醛溶液固定的心臟脫水，石蠟包埋切片后，在60℃烤箱中烘烤30min 以上，經(jīng)脫蠟水合后用0.2%Triton 通透組織細(xì)胞。用8%羊血清封閉60min，減少非特異性染色。用p-NF -κB 一抗孵育過(guò)夜，Alexa Fluor?568 goat anti-rabbit 二抗孵育60min 后，DAPI 染細(xì)胞核封片。在顯微鏡下觀察并拍照。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0 軟件所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間的比較用非配對(duì)t -檢驗(yàn);多組之間的比較用多因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.葛根素減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚:術(shù)后12 周取材結(jié)果顯示AB 手術(shù)組小鼠心重體重比(heart weight/Body weight，HW/BW)，肺 重 體 重 比(lung weight/Body weight，LW/BW)，心重脛骨長(zhǎng)度比(heart weight/tibia length，HW/TL)明顯高于假手術(shù)組，表明胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的心肌肥厚模型成功，而葛根素+ AB 組的HW/BW、LW/BW、HW/TL 明顯低于AB 手術(shù)組(表1)，表明葛根素能顯著抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚。

表1 各組心肌肥厚程度比較

2.葛根素降低死亡率:術(shù)后12 周觀察到每組小鼠死亡情況，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組無(wú)死亡;AB 手術(shù)組小鼠死亡率為50%，表明小鼠多心力衰竭死亡;而葛根素+AB組小鼠死亡率為25%(P ＜0.05，圖1)。改組數(shù)據(jù)表明葛根素能提高心肌肥厚甚至心力衰竭小鼠的生存率。

圖1 各組件生存率的比較

3.葛根素抑制NF -κB 的核轉(zhuǎn)位:NF -κB 是參與心肌肥厚病理過(guò)程的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，主要參與炎癥、免疫、凋亡等多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在心肌肥厚過(guò)程中存在著NF-κB 信號(hào)通路的過(guò)度激活，因此本研究探討葛根素是否會(huì)通過(guò)阻斷NF -κB 信號(hào)通路抑制心肌肥厚的發(fā)展。小鼠心臟石蠟切片病理染色結(jié)果顯示，手術(shù)組小鼠心臟NF-κB 核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象明顯增多，而葛根素能顯著抑制NF -κB 的核轉(zhuǎn)位(圖2)，提示葛根素通過(guò)阻斷NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗心肌肥厚的作用。

圖2 各組NF-κB 核轉(zhuǎn)位的免疫熒光染色結(jié)果

討 論

以往的研究表明葛根素具有抗炎、抗氧化以及抗凋亡的作用，同時(shí)葛根素在心臟中能減輕心臟缺氧損傷、減少異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟纖維化且葛根素還能促進(jìn)心肌細(xì)胞的發(fā)育［6～10］。以往的研究更報(bào)道葛根在中國(guó)古代醫(yī)學(xué)已廣泛用于心血管疾病和糖尿病的治療［5］。然而葛根素在心肌肥厚中的作用尚不明確，鑒于炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡在心肌肥厚的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［12，13］。筆者猜測(cè)葛根素可能能夠抑制心肌肥厚的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葛根素能明顯減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，同時(shí)降低小鼠AB 術(shù)后心肌肥厚向心力衰竭發(fā)展過(guò)程中的死亡率。然而其作用機(jī)制需探明。

NF-κB 是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括5 個(gè)亞單位:Rel (cRel)、p65 (RelA，NF - κB3)、RelB 和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。NF -κB 通常以同源或異源二聚體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)相應(yīng)靶基因上的特異性結(jié)合序列結(jié)合而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，其主要參與調(diào)節(jié)炎癥、免疫、凋亡等多項(xiàng)病理生理過(guò)程。NF -κB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族中最常見(jiàn)的二聚體為p65/p50 組成的異源二聚體，在靜止的細(xì)胞中NF-κB 與其抑制蛋白IκB 結(jié)合，后者通過(guò)其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列阻止NF -κB 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位發(fā)揮作用，而當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IκB 磷酸化失活，NF-κB 向核內(nèi)轉(zhuǎn)移與特異性位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而發(fā)揮相應(yīng)作用［14］。在心肌肥厚過(guò)程中NF-κB 過(guò)度激活，通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)參與心肌肥厚的發(fā)展［15］。而本研究結(jié)果顯示葛根素能抑制NF-κB 的核轉(zhuǎn)位，提示葛根素發(fā)揮其抗心肌肥厚的作用主要是通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路。

本實(shí)驗(yàn)尚存在不足之處，對(duì)葛根素如何調(diào)節(jié)NF-κB 的具體機(jī)制尚不清楚，需要更進(jìn)一步研究探索。但總結(jié)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葛根素可能成為干預(yù)心肌肥厚和心力衰竭的新藥物，本實(shí)驗(yàn)為尋找防治心肌肥厚和心力衰竭的新靶點(diǎn)和新藥物提供了理論基礎(chǔ)。

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