豬細(xì)小病毒種子批中污染的豬鼻支原體的清除

郭龍飛 燕賀 楊霞 高東生 陳陸 常洪濤 王新衛(wèi) 趙軍 王川慶

摘要：支原體是細(xì)胞和病毒培養(yǎng)中常見的污染物，本研究嘗試使用濾膜過濾法、反復(fù)多次凍融法、支原體抑制藥物M-plasmocin處理法、氯仿抽提法等4種方法清除豬細(xì)小病毒種子批中污染的豬鼻支原體，并對4種方法的清除效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，支原體抑制藥物M-plasmocin處理法與氯仿抽提法效果較好，支原體抑制藥物處理84h以及氯仿與被支原體污染的豬細(xì)小病毒液作用5min均能徹底清除豬細(xì)小病毒種子批中污染的支原體。本研究篩選出的清除豬細(xì)小病毒中支原體方法為非囊膜類病毒種子批中支原體的清除提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：種子批；支原體；豬細(xì)小病毒；氯仿；M-plasmocin

中圖分類號：S852.65文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0222-03

生物制品是控制傳染病的有效工具。病毒種子批是制造生物制品的基礎(chǔ)，其直接關(guān)系到生物制品的質(zhì)量。許多需要借助體外細(xì)胞培養(yǎng)增殖的病毒常因載體細(xì)胞受到支原體污染而被污染，致使生物制品報廢[1]。支原體（Mycoplasma）是大小介于細(xì)菌和病毒之間的一類無細(xì)胞壁的原核細(xì)胞微生物，一般過濾除菌方法無法去除，因此支原體污染一般難于消除，約有30%～50%的細(xì)胞培養(yǎng)物中有支原體污染[2]。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)中主要有口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、梨支原體和萊氏無膽甾原體等支原體污染[3-5]。支原體污染會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，從而影響需要借助細(xì)胞培養(yǎng)的病毒增殖，病毒種子批的建立，疫苗和相關(guān)生物制品的生產(chǎn)。

被支原體污染有的病毒種子批接種細(xì)胞后，支原體多吸附于細(xì)胞表面或散在細(xì)胞之間，通過競爭營養(yǎng)和分泌有毒代謝產(chǎn)物影響細(xì)胞的生理特性，常會誤以為是病毒繁殖造成的病變效應(yīng)，使研究結(jié)果的真實性和可靠性大大下降[6]。利用被支原體污染的細(xì)胞增殖病毒時會干擾病毒的復(fù)制、影響病毒滴度[7]，進(jìn)而影響疫苗的免疫效果，并可導(dǎo)致免疫抑制[8]。細(xì)胞、病毒種子批、血清等的支原體污染均給科研、疫苗生產(chǎn)及生物制品產(chǎn)業(yè)帶來很多麻煩，甚至造成事故。我國藥典三部和歐洲藥典都明確提出要對生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)、病毒種子批、病毒收獲液和細(xì)胞建庫所用胰酶進(jìn)行支原體檢測[9-10]，以確保生物制品的質(zhì)量。

迄今已報道多種方法被用于去除或減少培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體，這些方法包括化學(xué)介質(zhì)克隆法、特異性血清處理法[11]、巨噬細(xì)胞吞噬法、抗生素處理方法等[12-13]，但這些方法存在效果不好和耗時長及成本高等缺點(diǎn)。

豬細(xì)小病毒引起豬繁殖障礙性疾病，其特征是感染母豬，使初產(chǎn)母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流產(chǎn)及病弱仔豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前對該病的防治主要通過給易感動物接種豬細(xì)小病毒滅活疫苗為主，制備疫苗的病毒質(zhì)量直接關(guān)系到疫苗質(zhì)量優(yōu)劣。本研究在去除豬細(xì)小病毒種子批中污染的支原體過程中，嘗試幾種不同方法，試圖摸索出有效去除病毒培養(yǎng)物中支原體的方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒和細(xì)胞

豬細(xì)小病毒（PPVHNZK-1第35代）；豬腎傳代細(xì)胞系（PK15）均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病學(xué)教研室保存。

1.1.2主要試劑和儀器

TaqTM酶、DL2000DNAmarker等為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液為美國Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品；支原體抑制藥物M-plasmocin為Invitrogen公司產(chǎn)品；氯仿為分析純。

1.2方法

1.2.1豬鼻支原體檢測

豬鼻支原體檢測參照Kobayashi等[14]建立的PCR方法，正向引物（F）：5′-TATCGCATGATGAGTAATAG-3′；反向引物（R）：5′-GCTGCGTTAGTGAAATTAT-3′，擴(kuò)增片段理論跨度為676bp，由生工生物（上海）股份有限公司合成，PAGE純化。DNA模板提取使用酚/氯仿抽提法，PCR擴(kuò)增體系：10×PCRbuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTPs50μmol/L，上下游引物各20pmol，TaqDNApolymerase2.5U，DNA模板0.1μg，加滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，58℃30s，72℃40s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2不同處理方法去除支原體效果比較

分別采用過濾法、反復(fù)凍融法、支原體抑制藥物處理法和氯仿抽提法處理污染有豬鼻支原體的豬細(xì)小病毒培養(yǎng)物，具體操作為：過濾法是使用無菌注射器抽取1mL污染有支原體的豬細(xì)小病毒液通過0.10μm濾膜過濾，分別過濾1、2、3次。反復(fù)凍融法是將污染有支原體的豬細(xì)小病毒液分別反復(fù)凍融5、10、15次。支原體抑制藥物處理法是在污染有支原體的豬細(xì)小病毒液中加入終濃度為25μg/mL的支原體抑制藥物M-plasmocin于4℃下作用，設(shè)置12、24、36、48、60、72、84、96h8個作用時間。氯仿抽提法是將污染有支原體的豬細(xì)小病毒液與等體積氯仿混合，劇烈振蕩混勻后在室溫靜置作用，設(shè)5、10、15、20、25、30min6個作用時間，然后1000g離心5min，分別取上清用于接種細(xì)胞。將上述方法處理后的病毒液分別接種豬細(xì)小病毒敏感的豬腎（PK-15）細(xì)胞系，待90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時收毒，并將收獲的病毒連續(xù)傳代5次，利用PCR方法逐代檢測支原體，以評價每種方法去除支原體的效果。

2結(jié)果

圖1顯示，分別將污染有支原體的豬細(xì)小病毒液用0.10μm濾膜過濾1、2、3次后接種PK-15細(xì)胞，在收獲的第5代病毒液中仍能檢測到豬鼻支原體。圖2顯示，分別將污染有支原體的豬細(xì)小病毒液凍融5、10、15次后接種PK-15細(xì)胞，在收獲的第5代病毒液中仍能檢測到豬鼻支原體。

使用支原體抑制藥物M-plasmocin對豬細(xì)小病毒液于37℃水浴中作用不同時間，處理12～72h后接種PK-15細(xì)胞，收獲第5代病毒液中豬鼻支原體檢測為陽性，處理84～96h后接種PK-15細(xì)胞，第5代病毒液中支原體檢測結(jié)果為陰性（圖3）。表明該藥物對豬鼻支原體有抑制和消滅的作用，在37℃作用84h以上能清除豬細(xì)小病毒種子批中污染的豬鼻支原體。

[FK（W13][TPGLF3.tif；S+3mm][FK）]

使用氯仿處理污染有支原體的豬細(xì)小病毒液，結(jié)果表明，氯仿處理5～30min后接種PK-15細(xì)胞，收獲的第5代病毒液中豬鼻支原體檢測結(jié)果均為陰性，作用5min即可有效地清除豬細(xì)小病毒種子批中污染的支原體（圖4）。

3討論

豬細(xì)小病毒引起種豬的繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前對該病的防治主要是以滅活疫苗免疫為主，因此制備滅活疫苗的病毒種子批質(zhì)量直接關(guān)乎疫苗成品的質(zhì)量和安全性，支原體是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的污染物質(zhì)[15]，并由此污染病毒種子批，由于支原體可引起細(xì)胞病變，干擾病毒復(fù)制[16]，影響疫苗病毒的產(chǎn)量和質(zhì)量，并有可能對疫苗的使用帶來危險，因此需要一種簡單有效且對病毒感染性沒有影響的方法來消除支原體[17]。

支原體大小介于細(xì)菌和病毒之間，最小為0.2μm，但其具有變形性，使用0.10μm濾膜過濾時，在一定壓力下可能改變形態(tài)通過濾膜，所以僅通過濾膜過濾不能完全清除支原體。不過可以相對減少支原體的含量，結(jié)合其他清除支原體的方法可以更有效地清除支原體的污染。

支原體抑制藥物M-plasmocin是Invitrogen公司推出的用于清除細(xì)胞中支原體污染的試劑，它作用于支原體的蛋白系統(tǒng)和干擾其DNA復(fù)制，該藥物在推薦使用濃度對細(xì)胞幾乎沒有毒副作用。本研究在4℃水浴中，支原體抑制藥物M-plasmocin與污染有支原體的豬細(xì)小病毒液作用，84h能有效清除支原體。但是由于支原體抑制藥物M-plasmocin價格昂貴，該方法成本較高。

支原體具有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的膜樣結(jié)構(gòu)，其中膽固醇含量較多，約占36%，對保持其細(xì)胞膜的完整性具有一定作用。脂溶劑氯仿能與膽固醇發(fā)生作用并破壞支原體膜狀結(jié)構(gòu)，殺死支原體，而豬細(xì)小病毒不含脂質(zhì)囊膜，對氯仿不敏感。本研究利用豬細(xì)小病毒和支原體對氯仿敏感性不同，嘗試用氯仿抽提達(dá)到去除豬細(xì)小病毒液中污染的支原體。本試驗摸索了氯仿與豬細(xì)小病毒液的作用時間，表明靜置作用5min可有效清除豬細(xì)小病毒液中污染的支原體，表明氯仿抽提法對支原體的清除效果很好。由于脂溶劑氯仿對于具有脂質(zhì)囊膜的病毒具有破壞和滅活作用，故該方法只能用于清除非囊膜病毒中污染的支原體。支原體污染源可能存在于實驗室和生產(chǎn)的各個細(xì)節(jié)（工作環(huán)境、培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)基）。這就要求生產(chǎn)及檢驗過程中嚴(yán)格遵循生物制品生產(chǎn)及檢驗規(guī)范，做到對工作環(huán)境定期消毒，嚴(yán)格區(qū)分人員和物品的流通通道，實驗或生產(chǎn)操作前對操作平臺和生產(chǎn)設(shè)備徹底消毒。由于支原體污染比較隱蔽，一旦病毒種子批被支原體污染，將對生物制品質(zhì)量造成影響。所以實驗和生產(chǎn)過程中杜絕和清除支原體污染是保證病毒種子批純凈和生物制品質(zhì)量的基礎(chǔ)。

本研究用支原體抑制藥物處理和氯仿抽提2種方法成功地清除了豬細(xì)小病毒種子批中污染的支原體，而且這2種方法均不影響病毒的感染性，為疫苗等生物制品的質(zhì)量和安全提供了保障。

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